盐酸普拉格雷中基因毒性杂质对甲苯磺酸乙酯检测方案(液相色谱仪)

SSL-CA19-085Excellence in Science Excellence in ScienceLC-176 岛津企业管理(中国)有限公司分析中心Shimadzu(China)CO.，LTD. Analytical Applications Centerhttp：//www.shimadzu.com.cn上海市徐汇区宜州路180号B2栋咨询电话：021-34193996Hotline： 021-34193996Building B2， No.180 Yizhou Road， Shanghai 岛津 Nexera LC-40分析盐酸普拉格雷中的基因毒性杂质对甲苯磺酸乙酯 LC-177 摘要：本文采用岛津 Nexera LC-40 高效液相色谱仪，建立了盐酸普拉格雷中基因毒性杂质对甲苯磺酸乙酯的测定方法。方法采用 Shim-Pack GIST-HP C18-AQ (2.0 mm×100 mm，1.9 um)，以乙腈-水为流动相，0.5 mL/min 的流速进行梯度洗脱，检测波长为225nm。分析结果表明：该方法测定基线噪音良好，0.05 ug/mL 对甲苯磺酸乙酯对照品溶液 S/N 大于50。对甲苯磺酸乙酯在0.01~10 ug/mL浓度范围内线性关系良好，相关系数达0.9999以上，精确度在95.8%~103.5% 之间。0.05 ug/mL对甲苯磺酸对照品溶液连续进样6针，保留时间和峰面积RSD分别为 0.29%和1.77%，仪器精密度良好。对照品溶液室温10℃放置8h，溶液稳定性良好。待测盐酸普拉格雷原料中对甲苯磺酸乙酯的含量7 ppm， 低于毒理学关注阈值。低中高不同浓度加标回收率范围在94.96%~101.19%之间， RSD 范围为0.31%~2.32%，准确度良好，该方法能够有效地检测盐酸普拉格雷中的对甲苯磺酸乙酯。 关键词： Nexera LC-40高效液相色谱仪对甲苯磺酸乙酯盐酸普拉格雷 近年来，基因毒性杂质因存在重大的安全隐患，而受到了广泛关注。欧洲药物管理局(EMA)、美国食品药品监督管理局(FDA)及人用药品注册技术要求国际协调会议(ICH)等机构陆续发布了针对基因毒性杂质的指南，对该类杂质的控制与评估提出要求。2006年， EMA首先颁布了《基因毒性杂质限度指南》，提出有必要采用“可接受风险水平”的概念，以毒理学关注阈值(threshold of toxicological concern， TTC)控制基因毒性杂质， TTC 为 1.5 ug/day (终身癌症风险小于百万分之一)。根据患者每天预计的服用剂量，便可计算出原料药中所允许的基因毒性杂质的含量。 盐酸普拉格雷是日本第一三共制药和美国礼来公司共同开发的新一代口服抗血栓药物，于2009年2月获欧盟批准上市。盐酸普拉格雷合成方法较多，部分合成工艺中使用对甲苯磺酸进行脱保护，中间体经过对接和乙酰化后得到目标产物，产物选择以乙醇为精制溶剂时则会产生基因毒性杂质对甲苯磺酸乙酯。口 I实验部分 服盐酸普拉格雷的的推荐日负荷剂量为60 mg， 由此计算出原料中允许的对甲苯磺酸乙酯含量为 25 ppm。目前对甲苯磺酸乙酯残留量的检测多采用GC-MS，LC-MS 和 HPLC-UV 法。常规 HPLC 法往往需要较长的分析时长来满足基因毒性杂质与待测原料及其其它杂质之间的分离度。本实验使用岛津 Nexera LC-40高效液相色谱仪，以亚 2 um 填料色谱柱进行分离，建立了盐酸普拉格雷中基因毒性杂质对甲苯磺酸乙酯的分析方法。 Nexera LC-40 高效液相色仪仪是岛津公司2019年推出的液相新产品，该产品秉承了岛津一直以来的设计理念，同时还引入了智能分析(AI)、智能物联 (loT)等尖端技术。配置的二极管阵列检测器 SPD-M40 具有极高的灵敏度和卓越的线性范围(2.5AU)，三重控温技术能有效降低基线噪音并提供稳定的基线，因此，即使在高浓度的样品中，也能定量检测痕量的杂质组分，可为基因毒性杂质检测提供参考检测方法。 1.1仪器 本实验采用岛津 Nexera LC-40液相色谱仪，包括 CBM-40A Lite 系统控制器， DGU-405脱气机，LC-40B XR输送泵， SIL-40C XR自动进样器， CTO-40S 柱温箱， SPD-M40A 检测器， LabSolutions Ver. 5.97 色谱工作站。 图1岛津Nexera LC-40 高效液相色谱仪 1.2分析条件 色谱柱： Shim-Pack GIST-HP C18-AQ (2.0 mm i.d.×100 mm L， 1.9 um) 流动相：A，水；B，乙腈 流速： 0.5 mL/min柱 温：45℃ 检测波长：225nm 进样体积：10uL 洗脱方式：梯度洗脱，B相起始浓度为40%，时间程序如表1所示。 表1梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 7.00 Pumps Pump B Conc. 45 7.10 Pumps Pump B Conc. 95 9.00 Pumps Pump B Conc. 95 9.01 Pumps Pump B Conc. 40 12.00 Controller Stop 样品前处理 标准曲线溶液配制：取对甲苯磺酸乙酯对照品适量，精密称定，加乙腈溶解并稀释制成100 ug/mL的溶液，作为贮备液。分别精密量取贮备液适量，用5mM甲酸铵水：乙(3：2)逐级稀释制成0.01、0.02、0.05、0.2、1、2、5、10ug/mL的溶液即得。 供试品溶液配制：取盐酸普拉格雷原料约20 mg 置 10 mL容量瓶中，精密称定，分别加入1mL乙腈和5mM甲酸铵水：乙腈(3：2)溶解并定容至刻度，制得约2 mg/mL的样品溶液，经滤膜过滤后，取续滤液即得。 |结果与讨论 3.1检测波长选择 取 2 ug/mL 的对甲苯磺酸乙酯对照品溶液，于190 nm ~ 400 nm 波长范围内进行紫外吸收波长扫描。结果显示：对甲苯磺酸乙酯在 225 nm 波长处有最大吸收，故本实验选择225 nm 为检测波长。 mAU 图2紫外吸收波长扫描谱图 3.2标准溶液液相色谱图 图3空白溶剂色谱图 mAU 图4标准溶液色谱图 (0.05 ug/mL) 本实验中样品溶液浓度为2mg/mL，根据盐酸普拉格雷原料中允许的对甲苯磺酸乙酯含量限度(25ppm)，计算出对甲苯磺酸乙酯的限度浓度为 0.05 ug/mL。如图所示，该浓度下目标化合物的S/N 达到56.7，让定量结果的检测更加准确可靠。本实验使用新 Nexera 系列 SPD-M40 二极管阵列检测器，通过光学系统的改良，不仅扩大了线性范围(在一定条件下达到2.5 AU)， 还具备了卓越的噪音抑制能力，指定条件下噪音低于4.5×10-6 AU 性能。同时，流通池、分光器和光源室的三重控温技术，提高了检测器的稳定性。 3.3标准曲线 取0.01、0.02、0.05、0.2、1、2、5、10 ug/mL的对甲苯磺酸乙酯对照品溶液各10 uL进样，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标做标准曲线，标准曲线及线性信息如图5和表2所示。 图5对甲苯磺酸乙酯标准曲线 表2对甲苯磺酸乙酯线性信息 组分名称 线性范围 (ug/mL) 线性方程 相关系数(R) 精确度(%) 对甲苯磺酸乙酯 0.01~10 Y=74041.5X-263.090 0.99998 95.8~103.5 3.4精密度实验 取0.05 pg/mL限度浓度的对照品溶液10 uL，连续进样6次，考察仪器精密度，测定结果见表3。结果显示：连续测定6次，对甲苯磺酸乙酯保留时间和峰面积的 RSD 分别为 0.29%和1.77%，仪器精密度良好。 表3重复性结果 ID 保留时间 峰面积 4.695 3264 2 4.690 3231 3 4.702 3210 4 4.724 3197 5 4.688 3268 6 4.690 3113 RSD (%) 0.29 1.77 图6重复性色谱图 3.5溶液稳定性 取 0.05 ug/mL对照品溶液，室温10℃放置，分别于0 h、1h、2h、4h、6h、8h取样进行分析，对照品溶液稳定性结果如表4。结果显示：室温10℃放置8h，对甲苯磺酸乙酯峰面积无明显变化，峰面积RSD为1.68%，对照品溶液稳定性良好。 表4对照品溶液稳定性结果 序号 取样时间(h) 峰面积 RSD(%) 3264 1.68 2 3113 3 2 3210 4 4 3196 5 6 3236 6 3162 3.6样品测定 取2mg/mL的样品溶液10 pL进样，样品溶液色谱图如图7，将测定结果带入3.3项下标准曲线，测得样品中对甲苯磺酸乙酯的浓度是0.014 ug/mL，即待测盐酸普拉格雷原料中对甲苯磺酸乙酯的含量为7ppm，低于毒理学关注阈值。 图7样品溶液色谱图 (2mg/mL) 3.7加标回收率 取盐酸普拉格雷原料适量，分别加入对甲苯磺酸乙酯对照品0.2 ug、0.5 ug 和2.5 ug，按照上述前处理方法处理后，分别制得对甲苯磺酸乙酯加入水平为 0.02 ug/mL(限度浓度的40%)、0.05 ug/mL(限度浓度)和 0.25 ug/mL(5倍限度浓度)的2mg/mL样品溶液各3份，考察加标回收率。具体结果如下：低中高3种水平的加标回收率在94.96%~101.19%之间， RSD 为 0.31%~2.32%，该方法准确度良好。 图8样品加标色谱图(加标水平0.5ug) 表5加标回收率结果 序号 样品中杂质含量 (ug) 加标水平 (pg) 加标后杂质测定 含量(ug) 回收率(%) 平均回收率(%) RSD(%) 1 0.137 0.350 103.86 2 0.139 0.2 0.340 100.29 101.19 2.32 3 0.142 0.340 99.42 4 0.139 0.610 95.46 5 0.148 0.5 0.620 95.68 97.13 1.44 6 0.143 0.630 97.98 7 0.133 2.480 94.19 8 0.137 2.5 2.480 94.05 94.96 0.31 9 0.138 2.470 93.63 ■结论 本文采用岛津 Nexera LC-40 高效液相色谱仪，建立了盐酸普拉格雷中基因毒性杂质对甲苯磺酸乙酯的测定方法。方法采用 Shim-Pack GIST-HP C18-AQ (2.0mm×100 mm， 1.9 um)，以乙腈-水为流动相，0.5 mL/min 的流速进行梯度洗脱，检测波长为225nm。分析结果表明：该方法测定基线噪音良好，0.05 ug/mL对甲苯磺酸乙酯对照品溶液 S/N 大于50。对甲苯磺酸乙酯在 0.01~10 ug/mL浓度范围内线性关系良好，相关系数达0.9999以上，精确度在95.8%~103.5%之间。0.05 ug/mL对照品溶液连续进样6针，保留时间和峰面积 RSD 分别为 0.29%和1.77%，仪器精密度良好。对照品溶液室温10℃放置8h，溶液稳定性良好。待测盐酸普拉格雷原料中对甲苯磺酸乙酯的含量为7 ppm， 低于毒理学关注阈值。低中高浓度加标回收率范围在94.96%~101.19%之间， RSD 为 0.31%~2.32%，准确度良好，该方法能准确高灵敏地检测盐酸普拉格雷中的对甲苯磺酸乙酯。 本文采用岛津Nexera LC-40高效液相色谱仪，建立了盐酸普拉格雷中基因毒性杂质对甲苯磺酸乙酯的测定方法。方法采用Shim-Pack GIST-HP C18-AQ（2.0 mm×100 mm，1.9 µm），以乙腈-水为流动相，0.5 mL/min的流速进行梯度洗脱，检测波长为225 nm。分析结果表明：该方法测定基线噪音良好，0.05 µg/mL对甲苯磺酸乙酯对照品溶液S/N大于50。对甲苯磺酸乙酯在0.01~10 µg/mL浓度范围内线性关系良好，相关系数达0.9999以上，精确度在95.8%~103.5%之间。0.05 µg/mL对甲苯磺酸对照品溶液连续进样6针，保留时间和峰面积RSD分别为0.29%和1.77%，仪器精密度良好。对照品溶液室温10℃放置8 h，溶液稳定性良好。待测盐酸普拉格雷原料中对甲苯磺酸乙酯的含量7 ppm，低于毒理学关注阈值。低中高不同浓度加标回收率范围在94.96%～101.19%之间，RSD范围为0.31%～2.32%，准确度良好，该方法能够有效地检测盐酸普拉格雷中的对甲苯磺酸乙酯。