缬沙坦原料药中亚硝胺类遗传毒性杂质NDMA_NDEA和NMBA检测方案(液质联用仪)

SSL-CA19-156Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-416 岛津企业管理(中国)有限公司分析中心Shimadzu(China)CO.，LTD. Analytical Applications Centerhttp：//www.shimadzu.com.cn上海市徐汇区宜州路180号B2栋咨询电话：021-34193996Hotline： 021-34193996 LCMS-8050 同时检测专传毒性杂质NDMA、NDEA和 NMBA LCMSMS-416 摘要：本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8050联用同时检测遗传毒性杂质NDMA、NDEA和 NMBA的方法。NDMA 和 NDEA 采用内标法定量， NMBA采用外标法定量，相关系数大于0.999。三个浓度下保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在0.08~0.27%和1.30~3.86%之间。NDMA、NDEA 和 NMBA方法定量限分别为 0.100、0.020和0.020 ppm。缬沙坦原料药三个不同浓度样品加标回收率在88.3~106.8%之间，平行处理三次的相对标准偏差在1.04~7.12%之间。残留实验结果为阴性。 关键词：超高效液相色谱三重四极杆质谱亚硝胺类化合物遗传毒性杂质 遗传毒性杂质 (Genotoxic Impurity， GTI)是指化合物本身直接或间接损伤细细 DNA，产生基因突变或体内诱变，具有致癌可能。药物生产等过程中引入或产生的亚硝基化合物(N-nitroso compounds)是一类含有N-NO基的强致癌化合物，属于遗传毒性杂质。2018年以来，沙坦类药物中陆续被发现检出亚硝基类化合物 NDMA、NDEA 和NMBA，引起社会的广泛关注，并给相关企业造成巨大损失。沙坦类药物作为高血压用药，具有服药时间长的特点，因此其中可能含有的亚硝基类遗传毒性杂质将产生致癌风险， 故需要进行严格的检测和管控。目前FDA规定沙坦类抗高血压药物中NDMA、NDEA、NMBA相对含量的限量标准分别为0.3、0.083、0.3ppm。 目前 FDA 和 EDQM 均已公布NDMA和 NDEA单独测定的 LC-MS/MS分析方法， EDQM 公布了 NMBA单独测定的 LC-MS/MS分析方法法。本文参考以上分析方法，采用岛津三重四极杆液质联用仪 LCMS-8050，建立了同时测定缬沙坦原料药中 NDMA、NDEA和NMBA三种亚硝基类化合物的方法，供相关检测人员参考。 I实验部分 1.1仪器 本实验使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A与三重四极杆质谱仪 LCMS-8050联用系统。具体配置为 LC-30AD×2输液泵， DGU-20A5在线脱气机， SIL-30AC 自动进样器， CTO-20A 柱温箱， CBM-20A系统控制器，LCMS-8050三重四极杆质谱仪， LabSolutions (Version 5.97)色谱工作站。 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱：Shimadzu Shim-pack Velox C18 2.1×100 mm， 1.8 um 流动相：A-0.1%甲酸；B-甲醇 洗针模式：进样前后洗针，External only (进样针外壁清洗)， Rinse Port 流速：0.3 mL/min 柱主温：40℃ 进样体积：20uL 洗针液：甲醇/水=1：1 (v：v) 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为5%，时间程序见表1。 表1梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 0.01 Oven CTO.RVR 1* 1.00 Pumps Pump B Conc. 5 1.25 Oven CTO.RVR 0** 1.50 Pumps Pump B Conc. 30 3.50 Pumps Pump B Conc. 30 3.70 Oven CTO.RVR 1* 4.00 Pumps Pump B Conc. 95 6.00 Pumps Pump B Conc. 95 6.01 Pumps Pump B Conc. 5 8.50 Controller Stop 注：*“1”表示流路切换至废液；**“0”表示流路切换至质谱。 质谱条件 离子化模式： APCI， 正离子模式 加热模块温度：200℃ 雾化气流速：4.4 L/min 干燥气流速： 3.0L/min 接口温度：300℃ 描模式：多反应监测(MRM) DL温度：150℃ 接口电压：4.0KV 碰撞气：氩气270kPa MRM参数：见表2 表2MRM参数 No. 中文名称 英文名称 缩写 CAS 号 前体 离子 产物 离子 Q1 Pre Bias(V) CE(V) Q3 Pre Bias(V) 1 N-亚削基二甲胺 N-Nitrosodimethylamine NDMA 62-75-9 75.15 58.00* -30.0 -16.0 -27.0 42.95 -29.0 -18.0 -19.0 44.05 -13.0 -10.0 -24.0 2 N-亚硝基二乙胺 N-Nitrosodiethylamine NDEA 55-18-5 103.00 75.10* -10.0 -13.0 -30.0 47.00 -23.0 -18.0 -20.0 29.20 -30.0 -13.0 -30.0 3 N-亚硝基-N-甲 N-Nitroso-N-methyl-4- NMBA 61445- 147.00 117.00* -10.0 -11.0 -11.0 -4-氨基丁酸 aminobutyric Acid 55-4 43.95 -25.0 -16.0 -25.0 87.30 -29.0 -12.0 -29.0 4 代N-亚硝基二N-Nitrosodimethyl-d6-amine NDMA-d6 17829- 81.20 64.30* -30.0 -16.0 -30.0 甲胺 05-9 46.00 -15.0 -20.0 -20.0 5 氘代N-亚硝基二 N-Nitrosodiethyl-d10-amine NDEA-d10 1219794- 113.15 34.20* -10.0 -19.0 -10.0 乙胺 54-3 81.20 -21.0 -10.0 -22.0 *代表定量离子对。 1.3标准溶液配制 取三种亚硝胺类化合物混合标准贮备液(10mg/L)，以超纯水逐级稀释为0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100 ng/mL的标准系列工作溶液，再各取500mL， 加入 10 uL内标使用液，混混待测。 取内标贮备液 NDMA-d6 (50 mg/L)和 NDEA-d10 (50mg/L)， 以甲醇稀释为内标使用液 (NDMA-d6：1mg/L， NDEA-d10： 0.5mg/L)。 1.4样品前处理 准确称取 100 mg原料药样品至塑料离心管中，加入200 uL内标使用液，加入300uL甲醇，摇匀，超声提取 5 min， 加入9.5mL水，涡旋混匀，超声提取5 min， 4000 r/min 离心5 min， 上清液经过0.22 um滤膜过滤后，上机分析。 结果与讨论 2.1标准样品色谱图 图1 5.0ng/mL标准样品 MRM 色谱图 2.2线性关系 按照1.3配制九个不同浓度的标准系列溶液，按照1.2中的分析条件进行测定。使用 Labsolutions 软件(Ver.5.97)可以实现在一个方法里同时使用内标法和外标法进行定量的功能。本方法中NDMA和NDEA用内标法绘制标准曲线，， NMBA用外标法绘制标准曲线。各化合物标准曲线见图2，线性方程、相关系数、方法检出限(S/N=3， ASTM方式)和方法定量限 (S/N=10， ASTM 方式)见表3。 图2亚硝胺类化合物标准曲线 表3线性关系、检出限和定量限 名称 定量方法 校准曲线 线性范围 准确度(%) 相关系数r 定量限 (ng/mL) (ppm) NDMA 内标法 Y=0.0868X+0.0116 1.0~100.0 94.2~111.3 0.9991 0.1 NDEA 内标法 Y=0.1096X+0.0035 0.2~100.0 88.1~110.0 0.9993 0.02 NMBA 外标法 Y=23505X+65.0798 0.2~100.0 89.5~110.3 0.9999 0.02 2.3.精密度实验 对三个浓度的混合标准溶液连续6次进样，考察仪器的精密度，保留时间和峰面积的精密度结果如表4所示。三个浓度标准品的保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在 0.08~0.27%和1.30~3.86%之间，仪器精密度良好。 表4精密度结果(n=6) 名称 RSD%(2.0 ng/mL) RSD%(10.0 ng/mL) RSD% (50.0ng/mL) R.T. Area R.T. Area R.T. Area NDMA 0.25 3.86 0.23 3.86 0.20 2.18 NDEA 0.27 3.63 0.23 2.39 0.08 1.30 NMBA 0.19 2.90 0.17 2.31 0.08 1.78 2.4.加标回收实验 在缬沙坦原料药样品中添加三个不同浓度的标准溶液，每个浓度的加标样品平行处理三份，加标回收结果见表5。缬沙坦原料药中未检测出三种亚硝胺类化合物。三个不同浓度加标回收率在 88.3~106.8%之间，平行处理三次的相对标准偏差在1.04~7.12%之间，方法准确可靠。 表5样品加标回收率(n=3) 化合物名称 样品测定结果 2.0 ng/mL 10.0 ng/mL 50.0 ng/mL (ng/mL) 回收率% RSD% 回收率% RSD% 回收率% RSD% NDMA 未检出 105.5 5.14 106.8 5.05 97.6 5.44 NDEA 未检出 104.8 4.64 98.8 1.04 88.3 7.12 NMBA 未检出 93.9 6.09 96.1 5.60 91.1 5.09 2.5.残留实验 高浓度标准样品(100ng/mL)分析完成后，进样分析空白，考察残留情况。结果表明，亚硝胺类化合物检测通道中无明显目标化合物干扰。 图3.标准样品(100 ng/ml) 和残留考察空白样品叠加色谱图(黑线：标准样品；红线：空白样品) I结论 本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 联用同时测定缬沙坦原料药中NDMA、NDEA和NMBA三种亚硝胺类遗传毒性杂质的方法。使用 Labsolutions软件(Ver.5.97)实现内标法和外标法同时定量，NDMA和 NDEA 用内标法定量， NMBA用外标法定量，定量限分别为0.100、0.020和0.020 ppm，满足限量标准要求。本方法线性范围宽、重复性好、准确度高、前处理简单，适合用于三种亚硝胺类遗传毒性杂质的定量检测。 Building B2，No.180 Yizhou Road， Shanghai 本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A和三重四极杆质谱仪LCMS-8050联用同时检测遗传毒性杂质NDMA、NDEA和NMBA的方法。NDMA和NDEA采用内标法定量，NMBA采用外标法定量，相关系数大于0.999。三个浓度下保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在0.08~0.27 %和1.30~3.86 %之间。方法检出限在0.0044 ~0.0237 ppm之间，定量限在0.0147~0.0790 ppm之间。缬沙坦原料药三个不同浓度样品加标回收率在88.3~106.8%之间，平行处理三次的相对标准偏差在1.04~7.12%之间。残留实验结果为阴性。适用于沙坦类药物中三种亚硝胺类遗传毒性杂质同时定量检测。