厄贝沙坦中N-亚硝基二甲胺和N-亚硝基二乙胺检测方案(气质联用仪)

SSL-CA19-048Excellence in Science Excellence in ScienceGCMS-311 上海市徐汇区宜州路180号华鑫天地二期C801栋 咨询电话：021-34193996 http：//www.shimadzu.com.cnBuilding C801， No.180 Yizhou Road， Shanghai Hotline：021-34193996 HS-GC-MS 检测原料药厄贝沙坦中N-亚削基二甲胺和N-亚削基二乙胺 GCMS-311 摘要：本文利用岛津公司 GCMS-QP2020 NX 气相色谱-质谱联用仪结合 HS-20顶空进样器，建立了原料药厄贝沙坦中N-亚亚基二甲胺和N-亚硝基二乙胺的同时测定方法。在10~500ng/mL浓度范围内各组分线性关系良好，相关系数均达到0.999以上，100ng/mL标准品溶液连续进样6针，各组分峰面积 RSD 均小于2.40%。阴性空白样品在40， 80， 160ng/mL加标浓度时，回收率为100.6%-104.6%，阳性空白样品回收率为101.8%-108.7%。该方法简单方便，顶空进样不污染气化室，能够有效的检原原料药厄贝沙坦中N-亚硝基二甲胺和N-亚硝基二乙胺的含量。 关键词：顶空进样气相色谱-质谱联用仪沙坦类药物亚硝胺 NDMA NDEA 根据世界卫生组织国际癌症研究机构致癌物清单白，N-亚硝胺二甲胺 (N-Nitrosodimethylamine，NDMA) 和N-亚硝胺二乙胺(N-Nitrosodiethylamine，NDEA) 均属于2A类致癌物质，在ICHM7指南中明确该类化合物具有较高致癌性，对实验动物致癌性证据充分。 2018年7月，欧盟药品管理局报道在其对浙江某企业含有缬沙坦原料药的药物抽查汇总发现了杂质NDMA， 其平均含量达66.5ppm， 超过欧盟标准0.3ppm。21随后全球已有包括美国，加拿大，挪威，德国等22个国家召回共2300批该企业的含有沙坦类原料药的降压药。 相关药企沙坦原料药中的 NDMA经推断疑似来源于药物合成过程中使用的溶剂 N，N-二甲基甲酰胺(DMF)与亚硝酸钠在酸性条件下反应产生的微量副产物，即NDMA。由于通用工艺原因，厄贝沙坦和氯沙坦等沙坦类药物中也相继发现了 NDMA 和NDEA 杂质的存在。 I实验部分 1.1仪器 GCMS-QP2020 NX气相色谱-质谱联用仪 HS-20顶空进样系统 AP135W高性能电子天平 1.2试剂 NDMA和NDEA对照品(中国食品药品检定研究院) 为确保药物产品质量，控制潜在风险，，，很多制药公司已经将NDMA和 NDEA纳入沙坦类原料药内控质量标准中。 本文参考现行《中国药典》缬沙坦国家标准修订稿公示(第二次)中N-亚硝基二甲胺和N-亚硝基二乙胺检查法和美国 FDA 直接进样方法(Combineddirect injection N-Nitrosodimethylamine(NDMA) and N-Nitrosodiethylamine (NDEA)impurity assay by GC/MS)和顶空进样方法(Combined N-Nitrosodimetylamine (NDMA)and N-Nitrosodiethylamine (NDEA) impurityassay by GC/MS-Headspace)，建立了厄贝沙坦中N-亚硝基二甲胺和N-亚硝基二乙胺的检测方法。本方法检出限低，重现性好，顶空进样可明显降低高浓度样品直接进样对色谱气化室的污染，可以为沙坦类原料药中基因毒性杂质的检测提供参考。 1.3分析条件 HS-20条件： 20℃/min_240℃ (2 min) 平衡温度：130℃ 进样方式：不分流 定量环温度：150℃ 流速控制方式：线速度 传输线温度：160℃ 线速度：51.6cm/sec 平衡时间：15 min 离子化方式：EI 进样时间：2 min 离子源温度：230℃ GC-MS条件： 接口温度：230℃ 色谱柱：SH-Rtx-Wax(30m×0.25mm×0.5um) 检测器电压：调谐电压+0.2kV 柱温程序：60℃ (0.5 min)_15℃/min_150℃_ 采集模式： SIM，离子信息见表1 I样品前处理 空白溶液N-甲基吡咯烷酮侗(NMP)。 标准溶液采用天平精密称取适量对照品，以 NMP为溶剂，制备浓度约为 700ug/ml的贮备液。移取适量体积 NDMA和NDEA标准品贮备溶液，加NMP定量稀释制成浓度为对照品 1000ng/mL溶液。 线性溶液准确移取适量体量标准溶液至容量瓶中，用NMP逐级定量稀释制成浓度为 10，30，50，100，250，500ng/mL的溶液。 供试品溶液精密称取称贝沙坦原料药 1.0g于10mL容量瓶中，加 NMP溶解并定量稀释制成100mg/mL的溶液。 取2mL以上样品至20mL顶空瓶中，迅速密封，上机待测。 |结果与讨论 3.1 NDMA 和 NDEA标准溶液谱图 图1.NDMA和NDEA色谱图(100ng/mL) 表 1. NDMA和NDEA组分信息 No. 中文名称 英文名称 CAS号 保留时间 特征离子 1 N-二甲基亚消胺 N-Nitrosodimenthylamine 62-75-9 5.025 74.00 2 N-二乙基亚硝胺 N-Nitrosodiethylamine 55-18-5 5.770 102.00 3.2标准曲线和检出限 向6个20mL顶空瓶中各加入2mL浓度分别为10、30、50、100、250、500ng/mL的 NDMA 和NDEA混标，顶空进样，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标做标准曲线，标准曲线如图2所示。参照 ICHQ2(R1)方法学验证指南，使用标准曲线y轴截距标准偏差与斜率计算检出限(LOD) 和定量限(LOQ)，得到NDMA的LOD 和 LOQ分别为 1.71 ng/mL 和 5.18 ng/mL， NDEA 的LOD 和 LOQ分别为 4.53 ng/mL 和 13.74 ng/mL。结合供试品溶液的配制比例计算得 NDMA 的 LOD 和 LOQ分别为 0.0171 ug/g 和0.0518 ug/g， NDEA 的 LOD 和 LOQ分别为 0.0453 ug/g 和0.1374 ug/g。 图2.NDMA和 NDEA标准曲线 表2.NDMA和NDEA线性相关系数及检出限定量限 ID 组分名称 相关系数(R²) 定量限(ug/g) 检出限(ug/g) 1 NDMA 0.9999 0.0518 0.0171 2 NDEA 0.9998 0.1374 0.0453 3.3重复性和回收率实验 取100 ng/mL标准品溶液，连续进样6次，考察仪器的重复性，测定结果见表3。 表3.NDMA和NDEA重复性结果 ID 组分名称 峰面积1 峰面积2 峰面积3 峰面积4 峰面积5 峰面积6 RSD(%) 1 NDMA 7154 7060 7201 7313 7425 7387 1.96 2 NDEA 3140 3186 3175 3235 3338 3303 2.40 3.4加标回收率 平行精青称取1.0g厄贝沙坦供试品粉末9份至9个10mL容量瓶中，分别加含对照品 400ng， 800ng，1600ng的标准溶液，每个浓度各3份，用N-甲基吡咯烷酮稀释至刻度，得到含对照品浓度 40ng/mL，80ng/mL， 160ng/mL的供试品溶液各3份。阴性样品添加回收率结果如表4和表5所示。 表4.阴性样品 NDMA 添加回收率结果 ID 加标示度 (ng/mL) 平均加标检测浓度 平均回收率(%) RSD(%) (ng/mL) 1 40 41.73 104.3 2.59 2 80 82.78 103.5 1.53 3 160 167.41 104.6 1.27 表5.阴性样品 NDEA 添加回收率结果 ID 加标浓度(ng/mL) 平均加标检测浓度 平均回收率(%) RSD(%) (ng/mL) 1 40 40.24 100.6 1.81 2 80 81.92 102.4 1.52 3 160 165.05 103.2 1.96 3.5样品测试结果 取3种厄贝沙坦原料药供试品，按照上述前处理方法进行样品前处理，测定结果如表6所示，样品1和样品2均无杂质检出，样品3中检出NDEA。随后将样品3作为阳性样品进行加标回收实验，阳性样品NDEA 添加回收率结果如表7所示。 表6.样品中 NDMA和NDEA 测定结果 No. 中文名称 样品1 样品2 样品3 1 NDMA N.D N.D N.D 2 NDEA N.D N.D 0.3588 pg/g 注：N.D为未检出 表7.阳性样品 NDEA添加回收率结果 ID 加标浓度 (ng/mL) 平均加标检测浓度 平均回收率(%) RSD(%) (ng/mL) 1 40 79.85 108.7 2.68 2 80 117.84 101.8 1.13 3 160 205.93 106.2 2.13 I结论 本方法采用岛津 GCMS-QP2020 NX 结合 HS-20顶空进样器建立了厄贝沙坦原料药中 NDMA 和 NDEA的检测方法。该方法在10~500ng/mL范围内标准曲线线性良好，相关系数大于0.999， NDMA的检出限和定量限分别为 0.0171 ug/g 和 0.0518 ug/g， NDEA的检出限和定量限分别为 0.0453 ug/g 和0.1374ug/g。采用阳性样品厄贝沙坦原料药 NDEA的低中高加标回收率分别为 108.7%，101.8%，106.2%。该方法采用直接顶空检测，简单方便，不污染色谱气化室，能有效应用于检测厄贝沙坦原料药中NDMA和NDEA 的含量。 ( 参考文献 ) ( 1.世界卫生组织国际癌症研究机构致癌物清单， https：//monographs.iarc.fr ) ( 2. CHMP list of outstanding issues ， European Medicines Agency，EMA/CHMP/668548/2018 ) ( 3. ICH Harmonised Tripartite Guideline， V alidation o f Analytical Procedures： T ext and M ethodology Q2 (R 1 ) ) 岛津企业管理(中国)有限公司分析中心Shimadzu(China)CO.，LTD. Analytical Applications Center 本方法采用岛津GCMS-QP2020 NX结合HS-20顶空进样器建立了厄贝沙坦原料药中NDMA和NDEA的检测方法。该方法在10~500ng/mL范围内标准曲线线性良好，相关系数大于0.999，NDMA的检出限和定量限分别为0.0171 ug/g和0.0518 ug/g, NDEA的检出限和定量限分别为0.0453 ug/g和0.1374 ug/g。采用阳性样品厄贝沙坦原料药 NDEA的低中高加标回收率分别为108.7%，101.8%，106.2%。该方法采用直接顶空检测，简单方便，不污染色谱气化室，能有效应用于检测厄贝沙坦原料药中NDMA和NDEA的含量。