硫酸羟氯喹中质量分析检测方案(液相色谱仪)

SSL-CA20-057Excellence in Science Excellence in ScienceLC-199 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.-Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cn Tel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn HPLC 在硫酸羟氯喹质量分析中的应用 LC-199 摘要：本文建立了符合欧洲药典 (EP10.0)中硫酸羟氯喹有关物质及美国药典 (USP 43)中硫酸羟氯喹片含量测定的方法。采用岛津超高效液相色谱系统，参考EP方法，硫酸羟氯喹与杂质C、杂质B和杂质C分离良好；采用岛津常规液相色谱系统，参考USP 方法，对某市售硫酸羟氯喹片进行含量测定，结果分离度、重复性结果完全满足 USP对于硫酸羟氯喹片含量测定的要求。 关键词：硫酸羟氯喹 液相色谱欧洲药典(EP)美国药典(USP) 硫酸羟氯喹 (Hydroxychlorquine sulfate， CAS#：747-36-4) 于1955年在美国上市，目前已在加拿大、法国、德国、澳大利亚、中国、日本等70多个国家获得批准。最初硫酸羟氯喹被用于治疗疟疾，后来临床发现此药物具有轻度免疫抑制和免疫调节的作用，因此常用于类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、结缔组织病等众多疾病领域。在当前新型冠状病毒肺炎(COVID-19)流行的大背景下，老药新用强势闯入了大众视野，而硫酸羟氯喹即是其中之一。 初步表明，硫酸羟氯喹能够显著影响冠状病毒的受体ACE2 的糖基化水平。此前全球各地已纷纷紧急启动了硫酸羟氯喹治疗新冠肺病毒肺炎的临床试验。 药品质量是药物临床效果的基础保障，EP(欧洲药典)及USP (美国药典)中已经分别列举出硫酸羟氯喹有关物质考察、硫酸羟氯喹片含量测定的方法及要求。 细胞学试验筛选表明，硫酸羟氯喹能对冠状体病毒 SARS/MERS 具有显著的抑制作用。分子生化证据也 本实验参考EP方法，采用岛津超高效液相色谱系统，对硫酸羟氯喹有关物质进行检测；同时参考 USP方法，对某市售硫酸羟氯喹片含量进行测定；旨在为硫酸羟氯喹产品质量进行全面监控及评价。 实验部分 1.1仪器 本实验使用岛津超高效液相色谱 LC-30A 及常规液相系统LC-2040C3D，软件为 LabSolutions DBVer.6.87版色谱工作站。 1.2分析条件 -EP方法 (LC-30A超高效液相色谱系统) 色谱柱： EP10.001/2017：2849 C18 50×2.1 mm I.D.，1.7 um 流动相：A相-甲醇-缓冲液(10：90 v：v)；B相-甲醇-缓冲液(85：15v：v) 流速：0.7 mL/min 进样体积：4uL 柱温：40℃ 进样器温度：6℃ 洗脱方式：采用梯度洗脱，B相初始浓度为0%，时间程序见表1 表1梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 1.00 Pumps Pump B.Conc 11.00 Pumps Pump B.Conc 100 11.10 Pumps Pump B.Conc 0 12.50 Controlller Stop -USP 方法 (LC-2040C 3D 高效液相色谱系统) 色谱柱： Shim-pack GIST C18 250×4.6mml.D.， 5 um (PN： 227-30017-08， SGLC) 流动相：水：甲醇：乙腈：磷酸((800 mL：100 mL：100 mL：2 mL)， 含96 mg 戊烷磺酸钠 流速：1.0mL/min 进样体积：20uL 柱温：40℃ 进样器温度：6℃ 洗脱方式：等度洗脱 1.3样品制备 按照 EP10.0 及 USP43 要求进行制备。 实验结果 2.1EP方法测试硫酸羟氯喹有关物质 EP10.0中要求杂质C与硫酸羟氯喹、杂质B与杂质C分离度均需大于3.0。 图1码硫酸羟氯喹有关物质色谱图 表22硫酸羟氯喹有关物质色谱信息 Peak# Ret. Time Area Height Area% Resolution (EP) 1(杂质B) 4.701 16191 4885 0.251 二二 2 4.849 3007 642 0.047 1.337 3(杂质C) 5.732 3041 869 0.047 7.769 4(硫酸羟氯喹) 6.050 6421680 1570520 99.537 3.050 5 7.917 1770 542 0.027 18.378 6 8.251 1377 355 0.021 3.624 7 9.475 3153 1040 0.049 13.984 8 9.742 1333 449 0.021 3.206 Total 8.242 6451552 1579303 100 3.889 结果表明硫酸羟氯喹与杂质C、杂质B与杂质C分离度均大于3.0，完全满足EP方法要求。 2.2 USP 方法测试硫酸羟氯喹片含量 2.2.1分离度结果 USP 方法要求磷酸氯喹与硫酸羟氯喹的色谱峰分离度需不低于1.8。结果表明采用 USP 方法，硫酸羟氯喹与磷酸氯喹分离度为3.728，完全满足 USP 方法分离度大于1.8的要求。 2硫酸羟氯喹与磷酸氯喹标准样品色谱图 表3：分离度结果 Peak# Ret. Time Area Height Theoretical Plate Number Width(USP)/min Resolution (USP) 1 8.464 888，481 56，853 8107 0.410 / 2 10.050 751，613 44，490 8332 0.441 3.728 (>1.8) 2.2.2精密度考察 按照USP 方法要求，硫酸羟氯喹重复进样色谱峰峰面积RSD%应小于1.5%。]取硫酸羟氯喹标准品溶液(50 pg/mL))，重复进样5次，测定峰面积，计算目标物保留时间及峰面积RSD%，结果见表4。 表4精密度考察结果(n=5) 待测样品/浓度 保留时间 (RT/min) 峰面积(Area) 8.233 888，721 8.234 888，407 硫酸羟氯喹 (50pg/mL) 8.237 888，412 8.240 888，213 8.244 888，879 Average 8.238 888，526 SD 0.0047 268.15 RSD% 0.06 0.03 结果表明硫酸羟氯喹峰面积 RSD% 为 0.03%， 完全满足 USP 小于 1.5%的要求。 2.2.3实际样品含量测定 取某市售硫酸羟氯喹片(规格0.1g)20片，按照 USP 方法处理后进行检测(结果见表5)，标示含量计算公式如下： Result= (ru/rs)×(Cs/Cu)×100 ru=实测样品峰面积 rs=标准对照峰面积 Cs=标准对照浓度 (mg/mL) Cu=实测样品浓度(mg/mL) 表5标示含量结果 样品名称 标准对照 实测样品 标准对照浓度 实测样品浓度 标示量% 峰面积 峰面积 (mg/mL) (mg/mL) 888，481 0.05002 99.95 硫酸羟氯喹 888，526 888，904 0.05000 0.05000 100.04 888，879 0.05003 99.98 Average 888，754 0.05002 99.99 SD 237.3715 0.000015 0.036864 RSD% 0.03 0.03 0.04 结果表明某市售硫酸羟氯喹片其标示量的百分含量为99.99%，符合USP标准要求(不低于93.0%，，不高于107.0%)) 结论 采用岛津超高效液相色谱系统，参考EP10.0方法，对硫酸羟氯喹中有关物质进行检测，结果表明硫酸羟氯喹与杂质C、杂质B和杂质C分离良好，满足EP方法中分离度要求；采用岛津常规液相系统，参考USP43方法，对某市售硫酸羟氯喹片进行含量测定，结果硫酸羟氯喹与磷酸氯喹分离度为3.728、硫酸羟氯喹峰面积 RSD% 为 0.03%，结果完全满足 USP 对于硫酸羟氯喹片含量测定的要求。 岛津应用云 采用岛津超高效液相色谱系统，参考EP10.0方法，对硫酸羟氯喹中有关物质进行检测，结果表明硫酸羟氯喹与杂质C、杂质B和杂质C分离良好，分离度均大于3.0，满足EP方法中分离度要求；采用岛津常规液相系统，参考USP43方法，对某市售硫酸羟氯喹片进行含量测定，结果硫酸羟氯喹与磷酸氯喹分离度为3.728、硫酸羟氯喹峰面积RSD%为0.03%，结果完全满足USP对于硫酸羟氯喹片含量测定的要求。