厄贝沙坦中N-亚硝基二甲胺（NDMA）、N-亚硝基二乙胺（NDEA）检测方案(气质联用仪)

SSL-CA19-088Excellence in Science Excellence in ScienceGCMSMS-175 岛津企业管理(中国)有限公司分析中心http：//www.shimadzu.com.cn上海市徐汇区宜州路180号B2栋咨询电话：021-34193996Hotline： 021-34193996Building B2， No.180 Yizhou Road， Shanghai GCMSMS法结合顶空进样测定原料药厄贝沙坦中NDMA与NDEA含量 GCMSMS-175 摘要：本文使用岛津公司三重四极杆气质联用仪 GCMS-TQ8050 结合顶空进样建立了一种快速检测原料药厄贝沙坦中N-亚硝基二甲胺((NDMA)与N-亚基基二乙胺(NDEA) 的方法。在两个浓度范围 0.025~0.5ug与0.025~100ug两种物质均表现出良好线性，相关系数达到0.999以上，方法检出限(LOD) NDMA为0.013ug，NDEA 为 0.0024ug。标准品连续进样6针，0.1ug 与 5ug 峰面积RSD分别小于3%与2%。0.1ug、0.2ug与5pg的加标平均回收率在96.2%~106.4%之间。该方法简单方便，可以较好的应用于厄贝沙坦原料药中NDMA和 NDEA的含量的测定。 N-亚硝胺二甲胺 (NDMA)和N-亚硝胺二乙胺(NDEA) 是两种亚硝类类物质，根据2017年世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单这两种物质均属于2A类致癌物，而在ICH M7 指南中明确这两种化合物具有较高致癌性，对实验动物致癌性证据充分。 2018年7月中国浙江某制药企业爆发“缬沙坦事件”在业内引起震动，其出口的缬沙坦原料药被欧洲药品管理局查出含有杂质 NDMA。此事造成大量含有缬沙坦原料药的药品被召回。随着事态的发酵，厄贝 I实验部分 1.1仪器 GCMS-TQ8050 三重四极杆气相色谱质谱联用仪HS-20 顶空进样系统 1.2分析条件 顶空条件 平衡温度：130℃ 平衡时间： 15min 样品流路温度：150℃ GC-MS/MS条件 色谱柱： SH-Rtx-Wax，30m×0.25mmlD×0.5um 柱温程序：60℃(0.5min)_15℃ /min_ 150℃_20℃/min_ 240℃ (2min) 流速控制方式：恒线速度方式 线速度： 44.7mL/min 沙坦和氯沙坦等沙坦类药物中也相继发现了 NDMA与NDEA杂质的存在，这可能是沙坦类原料的通用工艺造成的。目前已有不少制少企业将 NDMA 与 NDEA纳入沙坦类药物的质量控制中。 目前 NDMA 与 NDEA 的检测方法有气质法与顶空+气质法。参考美国 FDA顶空进样方法本文采用顶空+三重四极杆气质建立了厄贝沙坦中NDMA 与 NDEA 的检测方法。本方法灵敏度高，重现性好，顶空进样可避免直接注入药品溶液对仪器造成污染，使用三重四极杆检测可提高检测的灵敏度。 传输线温度：160℃ 样品瓶加压气压：50kPa GC 循环时间： 25min 分流比：22.5 离子化方式：El 离子源温度：230℃ 色谱质谱接口温度：230℃ 检测器电压：调谐电压+0.6kV I样品前处理 精密称取厄贝沙坦原料药 500mg于20mL顶空瓶中，加N-甲基吡咯烷酮(NMP) 5mL溶解，迅速密封，上机待测。 I结果讨论 3.1NDMA与 NDEA标准谱图 图1NDMA与NDEA质量色谱图(0.1ug) 表1 NDMA与NDEA组分信息 No. 中文名称 CAS 号 保留时间 定量离子对 定性离子对 1 NDMA 62-75-9 5.016 74.00>42.10 74.00>44.10 2 NDEA 55-18-5 5.750 102.00>85.10 102.00>44.10 3.2标准曲线和检出限 配制7个梯度浓度的混标，，使各顶空瓶内的目标物含量分别为0.025、0.05、0.1、0.5、5、10、100ug，立即压盖密封，顶空进样。由于样品中的检出量可能较低也可能很高，参照 FDA 方法《CombinedN-Nitrosodimethylamine (NDMA) and N-Nitrosodiethylamine (NDEA) Impurity Assay by GC/MS-Headspace》制作0.025~0.5ug与 0.025~100ug两条标线，检测峰面积小于0.5pg标液则采用0.025~0.5pg标线，否则采用另一条标线，各标线如图2与图3所示。参照 ICH Q2 (R1)方法学验证指南，使用标准曲线y轴截距标准偏差(8)与斜率(S)计算检出限(LOD) 和定量限(LOQ)(计算公式LOD=3.38/S，L0Q=108/S)。各化合物线性相关系数、LOD、LOQ如表2所所。 图2 NDMA与NDEA标准曲线(0.025~0.5pg) 图2NDMA与NDEA标准曲线 (0.025~100ug) 表2NDMA和NDEA线性相关系数及检出限定量限 ID 组分名称 相关系数(R2) 相关系数 (R2) 定量限(ug) 检出限(ug) (0.025~0.5ug) (0.025~100pg) NDMA 0.9995 0.9999 0.040 0.013 2 NDEA 0.9999 0.9999 0.0071 0.0024 3.3重复性实验 取0.1ug与5pg标准品溶液，分别连续进样6次，考察仪器的重重性，测定结果见表3与表4。 表 3 NDMA和 NDEA 重复性结果果(0.1ug) ID 组分名称 峰面积1 峰面积2 峰面积3 峰面积4 峰面积5 峰面积6 RSD(%) NDMA 6，542 6，836 6，414 6，591 6，764 6，697 2.33 2 NDEA 6，219 6，320 6，282 6，188 6，304 5，997 1.92 表4 NDMA 和 NDEA 重复性结果((5pg) ID 组分名称 峰面积1 峰面积2 峰面积3 峰面积4 峰面积5 峰面积6 RSD(%) 1 NDMA 314181 312202 312531 316668 312629 305904 1.14 2 NDEA 293383 291324 290896 292，698 295224 280771 1.76 3.4加标回收率 检测厄贝沙坦样品未检出目标物，平行精密称取 500mg厄贝沙坦样品9份至9个20mL顶空瓶中，分别加含目标物 0.1ug， 0.2ug， 5ug的标准溶液，每个浓度各3份，再加入N-甲基吡咯烷酮使溶液总体积为5mL，密封，检测。添加回收率结果如表4和表5所示。 表4阴性样品 NDMA 添加回收率结果 ID 加标浓度 平均加标检测浓度 平均回收率( (%) RSD(%) (ug) (pg) 1 0.1 0.1024 102.4 1.97 2 0.2 0.1924 96.2 2.58 3 5 5.161 103.2 2.19 表5阴性样品 NDEA 添加回收率结果 ID 加标浓度 平均加标检测浓度 平均回收率(%) RSD(%) (ug) (ug) 1 0.1 0.1036 103.6 4.99 2 0.2 0.2010 100.5 1.61 3 5 5.318 106.4 1.25 ■结论 本方法采用岛津GCMS-TQ8050结合HS-20顶空进样器建立了厄贝沙坦原料药中NDMA 和NDEA 的检测方法。该方法在 0.025~0.5ug与 0.025~100ug范围内标准曲线均线性良好，相关系数大于0.999， NDMA的检出限和定量限分别为0.013pg 和 0.040ug， NDEA 的检出限和定量限分别为 0.0024 pg 和 0.0071ug。空白样品中以0.1ug， 0.2ug， 5pg三个浓度水平加标，平均回收率在96.2%~106.4之间。该方法灵敏度高、重复性好，采用顶空进样，前处理简便同时避免了直接注入药品溶液对仪器造成污染，可以较好的应用于厄贝沙坦原料药中 NDMA 和 NDEA的含量的测定。 Shimadzu(China)CO.，LTD. Analytical Applications Center 本方法采用岛津GCMS-TQ8050结合HS-20顶空进样器建立了厄贝沙坦原料药中NDMA和NDEA的检测方法。该方法在0.025~0.5μg与0.025~100μg范围内标准曲线均线性良好，相关系数大于0.999，NDMA的检出限和定量限分别为0.013μg和0.040μg, NDEA的检出限和定量限分别为0.0024 μg和0.0071μg。空白样品中以0.1μg，0.2μg，5μg三个浓度水平加标，平均回收率在96.2%~106.4之间。该方法灵敏度高、重复性好，采用顶空进样，前处理简便同时避免了直接注入药品溶液对仪器造成污染，可以较好的应用于厄贝沙坦原料药中NDMA和NDEA的含量的测定。