药物中6种亚硝胺类基因毒性杂质检测方案(液质联用仪)

thermoscientific热线 800 8105118电话4006505118www.thermofisher.com仅用于研究目的。不可用于诊断目的。 ◎2020 Thermo Fisher Scientific Inc. 保留所有权利。所有商标均为 Thermo Fisher Scientific Inc. 及其子公司的资产，除非另有指明。 Q Exactive高分辨质谱检测分析药物中6种亚硝胺类基因毒性杂质 刘国强，郑国帅，徐牛生，赛默默世尔科技(中国)有限公司色谱质谱部 关键词： QExactive，亚硝胺，基因毒性杂质，氯沙坦 前言 亚硝胺的化学式是NR，NO(R代表H或烃基)。大量的动物实验已确认，亚硝胺是强致癌物，并能通过胎盘和乳汁引发后代肿瘤。同时，亚硝胺还有致畸和致突变作用。人群中流行病学调查表明，人类某些癌症，如胃癌、食道癌、肝癌、结肠癌和膀胱癌等可能与亚硝胺有关。 自2018年7月在缬沙坦原料药中检出N-亚硝基二甲胺(NDMA)起，陆续在其它沙坦类原料药中也检出了各类亚硝胺杂质，如N-亚硝基二甲胺(NDMA)、N-亚硝基二乙胺(NDEA)等。进一步的调查发现，在个别供应商的非沙坦类的药物中(如雷尼替丁、、二甲双胍)，亦有亚硝胺类杂质的检出。因此为了保证药品的安全和质量可控，有必要对化学药品中亚硝胺类杂质进行全面的检测和控制。 GCMS和LCMS是药物中亚硝胺类杂质的常用分析测试方法，美国FDA先后发布了多版关于检测药物中亚硝胺类杂质的参考方法。在GCMS检测方法中因为使用较高温度会加热雷尼替丁样品可能会导致NDMA生成， LC-QQQ由于容易受到背景干扰难以完全排除检测过程中出现的假阳性，因此LC-HR MS高分辨质谱已成为FDA推荐的亚硝胺类化合物检测的首选方法[1-3。 本文基于QExactive超高分辨普谱仪建立了氯沙坦中6种亚硝胺(NDMA， NMBA， NDEA， NEIPA， NDIPA， 和NDBA)分析的高灵敏度检测方法。本方法可实现亚硝胺和氯沙坦主成分的有效分离，定量下限低于目前的限度要求，仪器的灵敏度高、重现性好，完全可以满足日常亚硝胺类基因毒性杂质的检测需求。 实验方法 1.仪器与试剂 Thermo Fisher Dionex Ultimate 3000超高效液相色谱仪、ThermoFisher Q Exactive超高分辨质谱仪、Thermo Scientific HypersilGOLD Phenyl色谱柱(P/N：25903-104630)，LCMS级甲醇(FisherA456-4)、LCMS级水 (Fisher W6-4)、LCMS级甲酸(Fisher A117-50)、Titan3 ， 17 mm PVDF过滤器， 0.22um(P/N： 42213-PV)。 2.样品前处理 2.1亚硝胺标准品储备液 用纯甲醇配置标准品，并用纯甲醇进行稀释，最终得到混标中6种亚硝酸的浓度均为100 ng/mL， 以此作为标准品储备液。 2.2成品药样品制备 称取适量药片粉末至15mL离心管中，加纯甲醇，涡旋1min，震荡40mins，得到API浓度约为10mg/mL的溶液。提取后， 4500rpm离心15mins， 取上清液过0.22um PVDF滤膜，滤液取至进样小瓶中供LCMS分析。 3.色谱方法 超高效液相UHPLC (Dionex Ultimate 3000， Thermo Fisher Scienti-fic ) 系统进行色谱分离，该系统由真空脱气机，自动进样器，柱温箱，和二元泵组成。采用Thermo Scientific Hypersil Gold Phenyl分析柱，此柱基于高纯硅胶设计，包含C4连接基团，具备中等疏水性，与芳香族化合物具有加强的 pi-pi相互作用，出众的保留能力和独特的选择性特别适合苯环和芳环化合物的分析。本实验中此柱对亚硝胺有较好的保留，和氯沙坦可以做到有效分离。 色谱条件 色谱柱 Hypersil Gold Phenyl (4.6*100mm， 3pm) 柱温 40℃ 流速 0.6mL/min 洗脱相A 0.1%甲酸-水 洗脱相B 0.1%甲酸-甲醇 梯度条件 时间(min) A% B% 0 90 10 1.5 90 10 7 45 55 17 45 55 17.1 10 90 21 10 90 21.1 90 10 25 90 10 进样体积 5uL 样品盘温度 6℃ 洗针液 甲醇：水=80：20(含0.1%甲酸) 3.质谱条件 仪器： Thermo ScientificTM Q ExactiveTM四极杆-静电场轨道阱高分辨串联质谱，HESI离子源参数： Spray Voltage+4.0KV/-3.2KV；Sheath Gas Pressure： 55arb； Aux Gas Pressure： 15arb； CapillaryTemp： 300℃； Heater Temp： 450℃； S-Lens：50。正负离子切换及t-SIM和PRM(平行反应监测)扫描方式采集数据，对于不同的化合物采用不同的扫描方式以降低背景干扰，获得最佳的检测及定量效果。 表2.6种亚硝胺的质谱扫描方法 Impurity NDMA NMBA NDEA NEIPA NDIPA NDBA Scan Type PRM t-SIM PRM PRM t-SIM PRM Polarity Positive Negative Positive Positive Positive Positive Scan Start-End 1.5-4.4 4.5-6.39 6.4-8.09 8.1-9.49 9.5-11.0 14.9-17.0 (min) m/z Isolated for 145.0619 103.0866 117.1022 131.1179 159.1492 PRM/t-SIM 75.0553 NCE 30 N/A 30 10 N/A 30 Isolation Window 1.5 m/z 1.5 m/z 1.5 m/z 1.5 m/z 1.5 m/z 1.5 m/z Microscans 3 3 3 3 3 3 Resolution 35，000 70，000 35，000 35，000 70，000 35，000 AGC target 2.00E+05 1.00E+06 2.00E+05 2.00E+05 1.00E+06 2.00E+05 1.灵敏度测试 QExactive具有超高分辨率及质量精度，在亚硝胺定量检测的过程中可以排除背景离子的干扰④，有效的避免假阳性以获得准确的定量结果。图1和2分别为6种亚硝胺的(NDMA， NMBA， NDEA， NEI-PA， NDIPA， 和NDBA)的检测限(LOD)及定量限(LOQ)的检测结果。 图2.NDMA， NMBA， NDEA， NEIPA， NDIPA， 和NDBA的定量限(LOQ)示例色谱图 2.系统适应性及线性范围测试 根据FDA推荐方法进样顺序要求，序列中初始6针标准品溶液(2ng/ml)6个亚硝胺测试的相对标准偏差均小于2%，整个序列中标准品溶液相对标准偏差也小于2%。采用上述仪器方法， NDMA在 0.5 ng/mL-100ng/mL、NMBA在 0.2 ng/mL-100ng/mL、NDEA在 0.5 ng/mL-100ng/mL、NEIPA在 0.2 ng/mL-100ng/mL、NDIPA在0.5 ng/mL-100ng/mL、NDBA在0.5 ng/mL-100ng/mL浓度范围内，线性相关系数R2大于0.999，线性关系良好。 图3.NDMA， NMBA，NDEA， NEIPA， NDIPA， 和NDBA的标准曲线图 通过对稀释的样品进行测定，-)可知API氯沙坦的出峰时间为20.3min，实际样品测定过程中色谱出峰17min以后的洗脱液均切入至废中。通过对某品牌氯沙坦片剂进行测定，检测到NDMA的浓度约为0.807 ng/ml(相当于样品中NDMA的含量为0.04ppm， 未超出目前已有的关于NDMA的限度要求)。 图4.氯沙坦样品中亚硝胺测定的色谱图 结论 本文建立了基于Q Exactive系列超高分辨质谱分析氯沙坦样品中基因毒性杂质NDMA， NMBA， NDEA， NEIPA， NDIPA， 和NDBA的检测方法，该方法的灵敏度及重现性完全可以满足FDA要求。同时，根据不同客户需求，我们可提供不同的仪器控制及数据处理软件，有适合常规检测需求的Xcalibur和TraceFinder软件，也有完全合规的Chromeleon软件，针对不同用户提供从仪器到软件的全面解决方案。 ( [1]. FDA F Y19-107-DPA-S_ Li q uid Chromatography-High ResolutionMass Spectrometry (LC-HRMS) Method for the Determination ofSix Nitrosamine I mpurities in ARB D rugs (https：//www.fda.gov/ media/125478/download) ) ( [2]. FDA FY19-177-DPA-S_ Liquid Chromatography-High ResolutionMass Spectrometry (LC-HRMS) Method for the Determination ofNDMA in Ranitidine Drug Substance and Drug Product ( https：//www.fda.gov/media/130801/download) ) ( [3]. FDA FY20-058-DPA-S_Liquid Chromatography-High ResolutionMass Spectrometry ( L C-HRMS) Method for the Determination ofNDMA in Metformin D r ug S u bstance and Dr u g Pr o duct ( https：//www.fda.gov/media/134914/download) ) ( [4]. Application Note： 19045， Q Exactive超高分辨质谱检测分析雷尼 替丁中的N-亚硝基二甲胺 ) 本文建立了基于Q Exactive系列超高分辨质谱分析氯沙坦样品中基因毒性杂质NDMA, NMBA, NDEA, NEIPA, NDIPA, 和NDBA的检测方法，该方法的灵敏度及重现性完全可以满足FDA要求。同时，根据不同客户需求，我们可提供不同的仪器控制及数据处理软件，有适合常规检测需求的Xcalibur和TraceFinder软件，也有完全合规的Chromeleon软件，针对不同用户提供从仪器到软件的全面解决方案。