培非格司亭及其生物类似药中对比检测方案(液质联用仪)

thermoscientific热线8008105118电话 400 6505118www.thermofisher.com仅用于研究目的。不可用于诊断目的。 ◎2020 Thermo Fisher Scientific Inc. 保留所有权利。所有商标均为Thermo Fisher Scientific Inc. 及其子公司的资产，除非另有指明。 使用Q Exactive HF-X高分辨质谱平台对培非格司亭(Neulasta)及其生物类似药进行对比 1.前言 粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulatingfactor， G-CSF)是肿瘤病人化疗后提升白细胞的标准疗法，其中重组人粒细胞集落刺激因子(recombinant human granulo-cyte colony-stimulating factor， rhG-CSF)已经广泛应用于化疗和放疗引起的白细胞数减少症。成熟的内源性人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)由174个氨基酸构成，分子量为18-20kDa。利用基因工程技术， Amgen公司在1991年上市了大肠杆菌发酵的短效版G-CSF非格司亭(Neupogen)，2001年上市了长效版G-CSF培非格司亭(Pegfilgrastim， Neulasta)。Neupogen和Neulasta两者的区别在于长效版使用了PEG的修饰技术， 使CSF的分子量和体积变大，延长了半衰期，从而把化疗周期内的注射次数从7-10次减少到1次注射，增加了临床使用的便利。 PEG修饰使蛋白相邻电荷态之间叠加非常严重I3，4]，为了降低蛋白电荷数，需要在色谱流动相中使用三氟乙酸(TFA)，取代常用的甲酸(FA)，使样品m/z向高质量端移动，从而减少相邻电荷态之间的信号叠加；在质谱中PEG修饰的蛋白会发生去PEG化，为了避免此种情况，要在柱后添加三乙基胺 (TEA)；TEA同时也可以起到降低蛋白电荷态的作用同。 实验方法 ( 仪器及试剂 ) ·ThermoTM Q Exactive HF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap MassSpectrometer ( · ThermoTM Ulimate3000 3400RS UHPLC system ) · Thermo ScientificTM Acetonitrile， UHPLC-MS grade ThermoScientificTM PierceTM Trifluoroacetic Acid， Sequencing gradeSigma-Aldrich Triethylamine，≥99% 实验样品 总共两个PEG-rhG-CSF类样品，一个是原研药Neulasta，另一个是仿制药Biosimilar。样品均为无色澄清溶液。 样品前处理步骤 以Millipore Water将两个样品分别稀释至1mg/mL后上LC-MS平台分析，测定其完整分子量。 实验方法设置 液相色谱实验条件： 流动相： A(50%ACN+0.1%TFA)， B(95%ACN+0.1%TFA)；柱温：50℃； 流速：0.3mL/min； Postcolumn-addition： 400mM TEA in water， 5pL/min； 上样量：1pg. 色谱梯度如表1所示；为减少TEA及TFA对质谱系统的污染，3min之后的组分均通过质谱自带六通阀切入废液。 No. Time(min) Flow(ml/min) %B 1 1.0 0.3 15 2 7.0 0.3 60 3 8.0 0.3 99 4 9.0 0.3 99 5 9.5 0.3 28 6 10 0.3 28 表1色谱梯度 质谱实验条件： Runtime FULL MS 0 to 10 min Polarity positive In-source CID 70.0 eV Microscans 10/2 Resolution 15，000/120，000 AGC target 3e6 Maximum IT 200 ms Scan range 1000 to 6000 m/z Spray Voltage 4000V Probe Heater Temp. 70℃ S-Lens RF Level 50 表2质谱实验条件 数据处理软件 使用Thermo Scientific BioPharma Finder 3.2软件进行完整分子量分析，实验参数如图1所示。 图1 BioPharma Finder解卷积参数设置 数均分子量(Mn， number-average molecular mass)、质均分子量(Mm， mass-average molecular mass)和PEG多分散性(PEG polydispersity， PD)根据解卷积结果计算而出，计算公式如下： 图2 Neulasta原始质谱图(R=15000) 图2为不同m/z范围的Neulasta原始谱图(R=15000)。从图中不难看出，即使是由于PEG修饰导致复杂程度大大增加的样品，仍然能够依靠Orbitrap质谱的高分辨率和高灵敏度将相邻质谱峰实现基线分离，得到高信噪比的谱图。 图3不同分辨率下Neulasta解卷积谱图(左， R=15000；右， R=120000，局部放大图) 图3展示了Neulasta样品在分辨率15000/120000下的解卷积结果。分辨率=15000时，总共检测到181个组分。由图中可见，随分辨率增高，相邻组分之间得到更好分离；当分辨率为15000时， 对于nPEG=483的组分，其理论与实测分子量偏差为-2.26Da；当分辨率为120000时，对于nPEG=483的组分，其理论与实测分子量偏差为0.35Da。可见随着分辨率的增高，可将分子量相近的组分分离开(上右图中红线与蓝线所示的两个组分)，从而提高分子量测定的准确度。 图4 Biosimilar原始质谱图(R=15000) 图4为R=15000时采集的Biosimilar原始质谱图。由图中可见，同样由于PEG修饰，导致样品高度复杂。对其进行解卷积处理(图5)，在15000分辨率下共检测到141个组分，同样呈正态分布，选取局部区域放大观察，各个组分之间均实现了基线分离(局部放大图)。 图5 Biosimilar解卷积谱图(R=15000) 图6 Neulasta与Biosimilar镜像图对比 使用BioPharma Finder软件对原研药和类似药进行镜像图对比，可见相比于原研药，生物类似药的分布整体向高质量端平移，说明修饰的PEG链分布不同。根据前述公式分别计算两个样品的Mn，M_和PD，结果如表3所示。由表3中可以明显看出，由于修饰PEG链的分布不同，导致原研药和类似药的M， M_和PD均有差异。 样品 Mm Mn PD Neulasta 39939.32174 39896.98880 1.0011 Biosimilar 40226.91232 40202.11802 10006 ( 表3原研药与类似似Mm， Mn及PD值。 ) 结论 在本文的研究中，我们在Q Exactive HF-X平台上对PEG修饰的Neulasta及其生物类似药分子量进行了测定，并计算了其数均分子量、质均分子量和PEG多分散性，以评估类似药与原研药的相似程度。从结果中可以看出，相比于原研药，生物类似药的分子量整体向高质量端平移，表明PEG修饰链的分布有所差异；得益于Orbitrap高分辨质谱平台的优异性能，对于高度复杂的PEG修饰样品，仍然能够实现相邻质谱峰间的基线分离，从而准确测得其分子量用以评估PEG修饰链的分布，从而对产品进行评估。 ( 参考文献 ) ( 1 Lyman GH， Dale DC， Culakova E ， Poniewierski MS， Wolff DA，Kuderer NM， H uang M， C r awford J . Annals of Oncology. 24 (10)：2475-84. ) 2 Harris， J. M.； Chess， R. B. Nat. Rev. Drug Discovery 2003，2，214-21. ( 3M a nn， M.； M e ng， C. K. ； Fenn， J. B . A n al. Chem. 19 8 9，61， 1702-1708. ) ( 4 T rimpin， S .； Plasencia， M . ； I s ailovic， D .； C lemmer， D. E. An a l.Chem. 2007，79，7965-74. ) 5 Huang， L. H.； Gough， P. C.； DeFelippis， M. R. Anal. Chem.2009，81，567-577. 在本文的研究中，我们在Q Exactive HF-X平台上对PEG修饰的Neulasta及其生物类似药分子量进行了测定，并计算了其数均分子量、质均分子量和PEG多分散性，以评估类似药与原研药的相似程度。从结果中可以看出，相比于原研药，生物类似药的分子量整体向高质量端平移，表明PEG修饰链的分布有所差异；得益于Orbitrap高分辨质谱平台的优异性能，对于高度复杂的PEG修饰样品，仍然能够实现相邻质谱峰间的基线分离，从而准确测得其分子量用以评估PEG修饰链的分布，从而对产品进行评估。