复方氨酚烷胺片中乙酰氨基酚和咖啡因含量检测方案(液相色谱仪)

2溶液制备 液相色谱，内标法，对乙酰氨基酚，咖啡因，氨茶碱 引言 复方氨酚烷胺片为用于临床上治疗上呼吸道感染，流行性感冒所引起的发热，头疼，四肢酸软等症状的非处方药，其处方中含有250mg 对乙酰胺基酚和15mg咖啡因等多种活性成分。 c. 氨茶碱 图1.三种化合物结构式 在中国药典(2010版)中未收载该品种，、E目前仅收载于国家药品标准手册第16册(标准编准：WS1-XG-015-2002)，该标准中仅采用稀盐酸回流1小时提取取乙酰氨基酚并采用亚硝酸钠溶液电位滴定法测定其含量，操作繁琐，耗时长，且滴定终点不易判定，造成结果准确度差，重现性低，因此对该产品质量控制带来不便。已有文献报道道定其中对乙乙氨基酚和咖啡因含量的 报道，但由于处方中咖啡因相对含量较低，加上样品制备过程和进样中所带来的误差3，采用外标法测定其结果准确度偏差较大。为保证结果准确，可选取合适的内标物3.4.5来对目标物含量进行结果修正。本研究采用液相色谱法测定复方氨酚烷胺片中对乙酰氨基酚和咖啡因的含量，并对方法学6可行性进行考察，同时选取氨茶碱做为内标物对咖啡因的含量进行结果修正，确保分析结果有着更好的准确性。 仪器配置 Thermo Ultimate 3000系统： 泵： LPG-3400 自动进样器： WPS-3000 柱温箱：TCC-3000 检测器：DAD-3000 色谱软件： Chromeleon 7.2 测定条件 色谱柱：Acclaim 120° C18，4.6×150mm，5pm，PN：059148， SN：003420 流动相：0.1%磷酸-甲醇(70：30) 流速：.11.0ml/min 进样量：10pl 柱温：30℃ 检测波长：275mm 精密称取 10mg 氨茶碱对照品置于100ml量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，做为内标物储备液。 精密称取15mg咖啡因对照品和200mg对乙酰氨基酚对照品置于100ml量瓶中，加入约5ml甲醇使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为混合标准品储备液。 分别吸取1，2，3，4，5ml 混合标准品储备液，置于100ml量瓶中，并分别加入5ml内标物储备液，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为线性范围测试溶液。 取10片样品，研碎并混合均匀，称取适量样品(相当含有250mg对乙酰氨基酚和15mg咖啡因)，置于100ml量瓶中，加入约50ml流动相，超声20分钟，放置至室温，用流动相定容至刻度，摇匀备用，作为母液。吸取 2ml母液转移至100ml量瓶中，并加入5ml 内标物储备液，用流动相定容至刻度，摇匀备用，作为供试品溶液。 结果与讨论 内标物与系统条件筛选 在内标物的选择上，通常要考虑如下因素：1)内标物在样品中不能存在，2)内标物的结构式与目标分子相似，以保证内标物与目标物及其他物质能够达到基线分离，3) 用内标法进行计算校准时，应向对照品溶液和样品溶液中加入相同量的内标物质，4)内标物质的响应值应在目标峰的线性范围内，5)内标法计算未知物的含量时，采用目标峰与内标峰的峰面积比值进行计算。在本研究中，咖啡因在样品溶液中浓度较低，直接采用外标法结果误差大，因此有必要采用内标物质进行结果修正，通过查阅文献，选取与咖啡因结构相似而在复方中不存在的氨茶碱做为内标物。在分离条件筛选上，参照文献，比较了磷酸二氢钾-甲醇，磷酸-甲醇体系，结果表明在磷酸-甲醇体系下，对乙酰氨基酚峰形对称(对称因子：1.00)，同时比较不同甲醇浓度对分离效果的影响，结果表明30%甲醇可快速将三个物质洗脱下来，且三个色谱峰均可达到基线分离，对目标峰的定量分析不产生影响，故流动相采用0.1%磷酸-甲醇(70：30)体系。 专属性试验 分别进样流动相(空白)、对照品和样品溶液进行分析，结果见图2与表1，表明空白溶剂无干扰，且样品中目标峰与相邻峰达到基线分离，不影响分析结果。 表1.峰分析结果 名称 时间(min) 峰宽(min) 对称因子 分离度 相对保留时间 相对响应值 对乙酰氨基酚 2.817 0.099 1.00 N/A 0.79 0.39 氨茶碱(内标物) 3.540 0.123 0.98 3.83 1.00 1.00 咖啡因 4.693 0.163 0.95 4.76 1.33 1.21 图2.专属性实验图谱 线性范围考察 取5种水平的混合标准品溶液，按照由低到高的顺序依 应浓度做线性回归，并用校准曲线计算定量限，结果见次进样，测定其峰面积与内标物峰面积的比值，并与相 表2. 表2.校准结果 名称 校准类型 水平数 相关系数 斜率 截距 LOQ(pg/ml) 对乙酰氨基酚 线性，有截距 5 0.99988 6.388 0.016 4.20 咖啡因 线性，有截距 5 0.99997 18.8711 0.003 0.32 重复性试验 取对照品溶液，连续进样5针，计算其保留时间和峰面积RSD%。结果见图3. 图3.重复性实验图谱 结果显示对乙酰氨基酚保留时间与峰面积RSD%分别为0.06%和0.05%，咖啡因的保留时间和峰面积RSD%分别为0.05%和0.31%，表明方法重现性良好。 样品测定与加样回收试验 取样品供试液按照色谱条件测定其含量，并向已知含量的样品中添加对照品溶液，并测定其加样回收率，结果见表3与4。 表3.加样回收率分析结果 名称 已知量(ng/ml) 加入量(ug/ml) 总量(pg/ml) 回收率(%) 平均回收率(%) 23.8780 20 44.0956 101.1 对乙酰氨基酚 24.0557 20 44.2480 101.0 100.7 24.0527 20 44.0635 100.1 1.4330 1.5 3.0229 106.0 咖啡因 1.4452 1.5 3.0258 105.4 105.8 1.4316 1.5 3.0215 106.0 样品1# 咖啡因(%) 对乙酰氨基酚(%) 外标法 内标法 外标法 内标法 94.9 94.8 95.2 94.7 2 95.7 95.2 95.7 94.9 3 96.4 95.8 95.8 94.8 4 95.9 95.9 95.2 94.8 5 95.9 95.9 95.4 95.0 平均值 95.77 95.53 95.45 94.86 样品2# RSD% 0.58 0.52 0.30 0.12 96.7 96.6 97.2 96.8 2 97.0 96.3 97.8 96.7 3 97.0 96.7 97.5 96.8 4 97.2 96.8 97.6 96.9 5 96.7 96.8 97.3 96.9 平均值 96.93 96.62 97.48 96.84 RSD% 0.22 0.21 0.25 0.10 结果与说明 通过前述方法学研究表明，该方法具有专属性良好，准确度高，重复性强，灵敏度高，J9可用于复方氨酚烷胺片中对乙酰氨基酚和咖啡因的含量测定。 本法中选取氨茶碱做为内标物，其结构式与咖啡因相似，通过在线光谱扫描比较，二者具有相似的紫外光谱曲线，且最大吸收在275nm 附近，且三种组分均达到基线分离，对分析结果不存在干扰效应，但对乙酰氨基酚其紫外光谱图与二者差别较大，且其最大紫外吸收在 246nm附近，但考虑到样品中二种组分的含量差别，为兼顾咖啡因含量分析，因此选择275nm 为检测波长。在采用内标法进行校准分析时13.5，基于样品中目标峰面积与内标物的峰面积比值来进行校准，因此要求目标峰的工作线性范围应该覆盖内标物的响应值范围，在本法中内标物的响应值已经超出对乙酰氨基酚的线性范围，故用内标法与外标法对其进行含量计算时存在较大误差。 ( [ 1 ]国家药典委员会，复方氨酚烷胺片国家药品监督管理局国家药品标准[S]，化学药品地方标准上升国家标准 第16册(WS1-XG-015-2002)：278-4 ) ( [2] 庄志伟， HPLC 法测定复方氨酚烷胺片中对乙酰氨基酚和咖啡因的含量[J]，海 峡 药学，2007，19 ( 3)：58 - 59 ) ( 3 J John Dolan， LC troubleshooting， LCGC North America[J]， 2012， 30(6)：474-58 1 ) ( [4]USP Convention， USP 3 6 ， General information--<621>Chromatography ) ( E lcio Cruz de Olivera， etc . Quim Nova， 2010， 33(4)：984-987 ) ( 国家药典委员会，中国药典(2010)二部附录 XIX A，药品质量标准分析方法验证指导原则 ) ( [7] H F assanY. Aboul-Enein， A c cred Qual Assur， 1 9 98(3)：497-498 ) ( [8] Gorge Lunn， HPLC methods for recently a pproved pharmaceuticals， Wiley： 2005 ) ThermoFisherSCIENTIFIC AN_C_LC-