阿莫西林药物中纯度检测方案(液相色谱仪)

4(2)克拉维酸和阿莫西林的定量分析 结论免费服务热线：8008105118400 6505118(支持手机用户)AN_C_LC-73 Vanquish R 系统在阿莫西林药物分析中的应用 龙珍诊刘晓达梁立娜赛默飞世尔科技(中国)有限公司 引言 药物及其杂质的定量、定性分析是药物质量控制和安全性检测的必须环节。60%以上的药物为碱性化合物"。然而，碱性化合物的分离检测一直是色谱领域的一大挑战(2.5。由于碱性化合物与色谱固定相之间的多位点作用1-9，导致碱性化合物拖尾、易过载、保留时间漂移、信噪比低和分离度差等问题。 增加流动相的离子强度可以在一定程度上改善碱性化合物的峰形并增加载样量110-13)。但单纯的提高离子强度，如使用50 mmol/L磷酸二氢钠缓冲溶液，碱性化合物峰形和载样量的改善程度十分有限。具有离液性质的盐(chaotropic salt) ，如高氯酸钠、三氟乙酸钠等不仅可以改变流动相的离子强度，而且可以与碱性化合物和固定相作用，极大的增强碱性化合物的保留并改善峰形和载样量14-19。离液盐具有类似离子对试剂的作用，但没有离子对试剂的缺陷如色谱柱难平衡，鬼峰，色谱柱损耗快等。 阿莫西林是一种广泛使用的抗菌药物。中国市场上，有数十家制药企业生产的阿莫西林在销售。发展阿莫西林主成分及杂质的定量、定性方法有利于该类药物的质量控制。阿莫西林是一种强极性含碱性基团的化合物，以低离子强度溶剂做流动相的反相分离无法为阿莫西林提供足够的保留和较好的峰形。中国药典2010版和欧洲药典2003版中， 以 50 mmol/L KH，PO (pH 5.0)-4%左右的乙腈做流动相，C18为固定相分析阿莫西林。在该条件下， 阿莫西林及其杂质的保留较弱，分离度十分有限。某公司对该方法进行改进120，以50 mmol/L KH，PO (pH 5.0)-1%左右的乙腈为流动相， Zorbax SB-Aq (4.6 x250 mmol/L，5 pm)为固定相，阿莫西林的保留仍然不超过7 min。此外，过低的乙腈浓度会降低C18的使用寿命，为方法的重复性和稳定性带来问题。 本文以高氯酸钠为流动相添加剂， Acclaim C18 为固定相发展了一种阿莫西林的分离检测方法，并将该方法用于了阿莫西林和克拉维酸的定量分析，阿莫西林样品的含量分析和纯度分析。 仪器 Vanquish R系列 泵： Vanquish Quaternary Pump 自动进样器： Vanquish Autosampler 柱温箱： Vanquish Column Compartment 检测器： Vanquish Variable Wavelength Detector 色谱柱： Acclaim C18 (4.6x250 mm，5 pm)， P/N：059149柱温：30℃ 流动相组成条件： (1))1以磷酸二氢钾为流动相添加剂：流动相：A-50mmol/L KH，PO (pH 5.0)/ACN (99/1， v/v)， B-50 mmol/LKH，PO (pH 5.0)/ ACN ( 80：20， v/v)； 梯度洗脱：0-15min，97.5%A-85%A， 15-25 min， 85%A； (2)以高氯酸钠为流动相添加剂：流动相： A-ACN，B-100mmol/L NaH，PO， (pH 2.8)， C-100 mmol/L NaCIOa， D-H，0。梯度条件：0-20 min，5%A-15%A，10%B， 40%C， 45%-35%D。 流速：：1mL/min 检测波长：220nm 样品及对照品 阿莫西林对照品、克拉维酸对照品和阿莫西林系统适应性样品购自中国药品生物制品检定所。阿莫西林克拉维 酸钾混悬剂购自R公司(国药准字H20010010)和L公司(国药准字 H20010773)。 (1)流动相种类对色谱行为的影响 如图1和表1所示，与以磷酸二氢钾为流动相添加剂相比，以高氯酸钠为流动相添加剂具有以下优势：第一，阿莫西林系统适应性样品中4个重点关注的组分具有更为对称的峰型(0.97≤ As≤1.02)和更窄的峰宽(W12≤0.127)。更窄的峰宽和更对称的峰形意味着更高的信噪比。第二，所有组分均具有更高的响应，不仅可以检测到4个主要成分，还可以检测到一些微量杂质(如保留时间从5min到7 min) 洗脱的色谱峰。第三，，可以增加弱保留组分的保留。尽管以5%乙腈做初始流动相，仍可以获得以磷酸二氢钾 (pH 5.0)-2%左右乙腈为起始流动相类似的保留时间窗口。更高的有机相有利于C18链的浸润，防止水相过多引起的固定相坍塌。第四，可以获得不同的分离选择性，四个重点关注成分的洗脱窗口更宽。 图1.以磷酸二氢钾(A)和高氯酸钠(B)为流动相分析阿莫西林系统适应性样品 表1.图1中四个主要成分的保留行为 峰编号 高氯酸钠体系 磷酸二氢钾体系 半峰宽(W12， min) 不对称因子 (As) 半峰宽(W12，min) 不对称因子 (As) 1 0.071 0.98 0.103 1.04 2 0.100 1.01 0.132 0.98 3 0.106 1.02 0.181 0.82 4 0.127 0.97 0.156 1.01 以高氯酸钠为流动相添加剂的阿莫西林分析方法具有较高的载样量，上样体积从5pL增加到20pL，主要色谱峰没有明显展宽和拖尾(如图2)。因此，该方法能更好的实现主成分和杂质成分的同时定量分析。 图2.以高氯酸钠为流动相添加剂，不同进样体积重叠图。从低到高，进样体积依次为5，10，20ul。 除了具有较好的峰形和较高的载样量，该方法还具有较好的保留时间重复性和峰面积重复性。如图3所示，克拉维酸和阿莫西林的保留时间重复性 RSD 值分别为0.25%和0.45%，峰面积重复性 RSD值分别为0.15%和0.09%。综上所述，选择高氯酸盐的方法做阿莫西林和克拉维酸定量分析具有明显的优越性。 Time [min] 图3.克拉维酸和阿莫西林的重复性分析(n=5) 克拉维酸和阿莫西林是阿莫西林药物中两种主要的有效成分。阿莫西林为广谱青霉素类抗生素，克拉维酸钾只有微弱的抗菌活性，但具有抑制β内酰胺酶的作用，两者合用，可保护阿莫西林免遭β内酰胺酶水解。测定药物中这两种成分的含量，可在一定程度上解释这类药物临床用药效果，对于该类药物原料药的质量控制具有意义。 i.不同浓度，相同进样体积做阿莫西林和克拉维酸的线性曲线 在0.065-65 pg/mL， 0.04-40 pg/mL范围内，进样体积为20pL，分别测定阿莫西林和克拉维酸的响应。以峰面积(A)为纵坐标，以浓度(C)为横坐标，得线性关系系图4所示。 图4.相同进样体积，不同样品浓度克拉维酸(左)和阿莫西林(右)线性曲线 ii.相同浓度，不同进样体积做莫莫西林和克拉维酸的线性曲线 以 325 ug/mL 阿莫西林和200 ug/mL克拉维酸为样品，进样1，2，4，6，8，10，15，20，25，30 pL做线性曲线。以峰面积(A)为纵坐标，以相对浓度(C)为横坐标，得线性关系如图5所示。 图5.相同样品浓度，不同进样体积克拉维酸(左)和阿莫西林(右)线性曲线 上述结果表明，无论是不同浓度样品进相同体积还是相同浓度样品进不同体积都可以为阿莫西林和克拉维酸获取较好的线性曲线。同时，两种方式得到的线性曲线具有相似的线性方程，表明Vanquish R具有较高的进样精度和进样准确度。 (3)阿莫西林药物中阿莫西林和克拉维酸含量测试 选取市场上两种常见的阿莫西林克拉维酸钾混悬剂为样品。将样品稀释希100 pg/mL左右，进样20pL做阿莫西林和克拉维酸含量测定，测试结果如表2和图6所示。 两种厂家的阿莫西林克拉维酸钾混悬剂中阿莫西林含量符合药典规定。R公司生产的药品中可以检测到明显的克拉维酸色谱峰，并且阿莫西林与克拉维酸的质量比符合4：1的比例。L公司的药品中无克拉维酸检出，与厂家的药品规格(阿莫西林和克拉维酸比例7：1)相去甚远。 表2.不种生产厂家阿莫西林药物中阿莫西林和克拉维酸的含量 公司名 阿莫西林 (mg/mg) 克拉维酸(mg/mg) R 0.170 0.042 L 0.188 注：-未检出 (4)阿莫西林样品纯度测定 选取R和L公司的阿莫西林克拉维酸钾混悬剂为样品。将样品稀释到1000 pg/mL 左右，进样20pL做阿莫西林样品杂质(除克拉维酸)和主成分含量分析(图7)。按照面积归一化法计算各样品中阿莫西林、克拉维酸和杂质百分含量如表3。 两种厂家的阿莫西林克拉维酸钾混悬剂中阿莫西林杂质含量均较低，符合2010版中国药典的规定：各杂质的峰面积之和不得大于7%，单个杂质峰峰面积不得超过2.5%。与L公司生产的阿莫西林克拉维酸钾干混剂相比，R公司的相应产品所含杂质更少(1.83%)。 图6.阿莫西林药物中阿莫西林的含量分析 表3.不种生产厂家阿莫西林药物中阿莫西林、克拉维酸和杂质的含量 公司名 阿莫西林(%) 克拉维酸(%) 杂质(%) R 74.64 23.53 1.83 L 94.89 5.11 注：-未检出 Time [min] 图7.阿莫西林药物的纯度分析 本文以Vanquish R 为液相系统，发展了阿莫西林药物的定性、定量分析方法。 ( ·该方法具有较宽的线性范围，可实现杂质和主成分的同时定量分析。说明VanquishR系统具有较高的进样精准度。 ) ( ·该方法具有适宜的保留时间，有较好的峰形和载样量。可实现更多杂质的分离检测。 ) ( ●该方法具有较好的峰面积重复性和保留时间重复性，显示了 Vanquish R 系统具有较高的流速精准度和进样精准度。 ) ·该方法可用于阿莫西林药物的主成分含量和纯度分析，对该类药物的质量控制具有重要的意义。 ( 参考文献 ) ( [1] Davies NH， Euerby M R， McCalley DV (2008) J. 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