三氯蔗糖中示差折光检测器检测方案(液相色谱仪)

thermoscientific 示差折光检测器检测三氯蔗糖性能测试 潘媛媛刘晓达金燕赛默飞世尔科技(中国)有限公司 关键词：：噪音；流动相；影响因素； RI 目标： 基于示差折光检测器在糖类检测中的重要作用，本文以三氯蔗糖国标方法为参考，对示差检测器的影响因素进行考察。 引言 示差折光检测器(RI)是一种通用型检测器，，它是通过检测样品组分与流动相折光指数的不同，对组分进行定量。RI对糖类检测灵敏度很高，检测限可达 10 g/mL，但受环境温度、流动相组成等波动的影响明显。 三氯蔗糖(Sucralose)，又称蔗糖素、蔗糖精或4，1，6，-三氯-4，1，6，-三脱氧半乳型蔗糖，是以蔗糖为原料经氯化作用而制得的，甜度可达蔗糖600倍。这种甜味剂具有无能量，甜度高，甜味纯正，高度安全等特点，是目前最优秀的功能性甜味剂之一，也适合糖尿病人食用，所以很多含三氯蔗糖的产品往往带有“无糖”、“低糖”的广告宣传。在食品行业中，三氯蔗糖目前最广泛的应用是在各类饮料中，如碳酸饮料、果汁饮料、果味饮料、植物蛋白饮料、茶饮料、功能性饮料、咖啡饮品、酒精饮料等产品中；不同于其他无热量甜味剂，加热也不会影响三氯蔗糖的味道或结构，它几乎可以用于任何需要用糖的地方，包括烹调和焙烤中。世界卫生组织下的食品添加剂联合专家委员会经过多次环境和安全研究，在1990年确定三氯蔗糖的每日允许摄入量为每千克15毫克。美国制定的安全限量更低，是每天每公斤体重5毫克。对于一个60公斤的成年人来说，一天的限量是0.3克。 本法根据食品安全国家标准22255-2014食品中三氯蔗糖 (蔗糖素)的测定，对三氯蔗糖进行了检测，并且对检测过程中的影响因素进行了考察。在该方法条件下，三氯蔗糖的定量限可满足定量限 0.02 mg/mL的要求。 ( 仪器 ) ( Thermo ScientificM DionexM UltiMateM 3000RS 色谱系统， 包括： ) -LPG-3400SD 色谱泵 -WPS-3000TSL 自动进样器(配置100pL定量环) ( -TCC-3000RS 柱温箱 ) ( - RefractoMax521 ) ( Thermo ScientificTM DionexTM ChromeleonTM 色谱工作站 ) ThermoFisher Thermo ScientificTM Target2 TM Nylon Syring Filters (0.45um， 30mm， P/N F2500-1)一次性使用无菌注射器，1mL(上海治宇医疗器械有限公司) 试剂与标准品 三氯蔗糖对照品(AccuStandard@， Inc.) 去离子水(18.2 MQ-cm， Thermo ScientificTM genPureProTM UV-TOC， P/N 50131948) 甲醇(99.9%， Fisher， P/N A452-4) 乙腈(99.9%， Fisher， P/N A998-4) 色谱条件 分析柱： Thermo Scientific Accucore C18，2.6 um 4.6*150 mm(P/N 17126-154630) 流速： 1mL/min 进样体积： 20 uL 柱温： 35℃ 检测器： 采集频率 10 Hz 运行时间： 15 min 结果与讨论 1、流动相组成的影响 由于不同试剂的折光率不同，受温度影响程度有差异，因此方法同步对比了甲醇和乙腈、50%甲醇/水和50%乙腈/水、11%甲醇/水和11%乙腈/水在相同流速 1mL/min 条件下，经过RI检测器后的噪音。 1.1、流动相分别为纯甲醇和纯乙腈时，连接反压管，监测基线噪音，甲醇：0.003 uRIU， 乙腈：0.007 uRIU； 噪音水平甲醇略低于乙腈。 1.2、流动相分别为50%甲醇/水和50%乙腈/水时，连接反压管，分别监测基线噪音，50%甲醇/水：0.006uRIU， 50%乙腈/水时：0.010 uRIU；噪音水平50%甲醇/水略低于50%乙乙/水。 图2.接反压管，50%甲醇/水和50%乙腈/水条件下监控噪音 1.3、流动相分别为11%甲醇/水和11%乙腈/水时，连接反压管，分别监测基线噪音，11%甲醇/水0.019 uRIU， 11%乙腈/水时：0.020uRIU； 噪音水平相当。 图3.接反压管，11%甲醇/水和11%乙腈/水条件下监控噪音 因此，可以表明，仅连接反压管时，含有甲醇及甲醇/水做为流动相时，总体噪音水平略低于乙腈及乙腈/水作为流动相。 2.连接反压管和色谱柱的影响 2.1、流动相11%乙腈/水时，分别连接反压管和 C1：色谱柱，监测基线噪音，发现连接反压管条件下噪音为0.020 uRIU，接色谱柱后噪音为0.151 uRIU；色谱柱对噪音影响明显。 图4.11%乙腈/水条件下，分别连接反压管和C1g色谱柱，监控噪音 2.2、流动相11%甲醇/水时，分别连接反压管和 C18色谱柱，监测基线噪音，发现连接反压管条件下，噪音为0.019 pRIU；接C18色谱柱，噪音为 0.024 pRIU；说明月醇-水流动相条件下，色谱柱对噪音基本无影响。 图5.11%甲醇/水条件下，分别连接反压管和C18色谱柱，监控噪音 综上结果，甲醇及甲醇/水作流动相时，RI检测器的噪音低于乙腈及乙腈/水做流动相，因此考虑使用甲醇/水作为流动相；在原标准方法22255-2014中，流动相条件为11%乙腈/水溶液，由于乙腈和甲醇的洗脱能力比约为1：0.6，因此确定最终方法中流动相组成为20%甲醇/水。 采用 Accucore C18， 2.6 pm 4.6*150 mm 为分析柱，将不同浓度的标准工作曲线溶液依次测定，取其峰面积值，以峰面积为纵坐标，标准溶液质量浓度为横坐标建立标准工作曲线，得到三氯蔗糖的线性回归方程和相关系数，如表1所示。以信噪比 S/N=10计算方法的定量限，结果见表1。 图6.三氯蔗糖标准谱图(0.2 mg/mL) 图7.低浓度三氯蔗糖谱图(0.02mg/mL) 表1.三氯蔗糖线性数据、线性范围和检出限 名称 线性：线性回归 线性范围 线性相关 定量限LOQ 类型 方程 (mg/mL) 系数R² (mg/mL)(S/N=10) 三氯 Loff A=2.9906 0.02~0.4 0.9998 0.02 蔗糖 C+0.0021 注：A-峰面积pRIU *min； C-进样浓度 mg/mL； Loff：标准曲线不强制通过原点 取三氯蔗糖对照品溶液0.1mg/mL，连续进样5针，见图8。测试结果表明，连续进样5针，保留时间和峰面积重复性均符合要求，结果见表2，表明该方法重复性良好。 表2.三氯蔗糖方法重现性数据(0.1 mg/mL，n=5) Name 保留时间 min 峰面积 uRIU *min 三氯蔗糖 0.37% 0.29% 图8.三氯蔗糖标准连续进样重复性谱图(0.1mg/mL) 赛默飞色谱及痕量元素分析 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 www.thermofisher.com 本方法采用 Accucore C18， 2.6 pm 4.6*150 mm， 20%甲醇/水作为流动相，对三氯蔗糖进行了方法学考察，证明该方法完全可以满足并优于 GB 22255-2014方法的灵敏度要求。 本文考察了甲醇和乙腈作为流动相体系，在RI检测过程中对系统噪音的影响，结果表明，同等条件下，甲醇流动相对示差检测器的背景噪音贡献，明显低于乙腈流动相；通过综合对比，确定本方法采用20%甲醇/水作为流动相。由于三氯蔗糖检测采用的是等度淋洗，经色谱柱流出的成分也会贡献RI 检测器的噪音，因此色谱柱选择时，建议选择冲洗干净、柱流失小的色谱柱，如Accucore C18色谱柱。 S CIENTIFIC 支持手机用户)A Thermo Fisher Scientific Brand   三氯蔗糖（Sucralose）， 又称蔗糖素、蔗糖精或4 , 1 , 6 , -三氯- 4 , 1 , 6 , - 三脱氧半乳型蔗糖，是以蔗糖为原料经氯化作用而制得的，甜度可达蔗糖 600 倍。这种甜味剂具有无能量，甜度高，甜味纯正，高度安全等特点，是目前最优秀的功能性甜味剂之一，也适合糖尿病人食用，所以很多含三氯蔗糖的产品往往带有“无糖”、“低糖”的广告宣传。在食品行业中，三氯蔗糖目前最广泛的应用是在各类饮料中，如碳酸饮料、果汁饮料、果味饮料、植物蛋白饮料、茶饮料、功能性饮料、咖啡饮品、酒精饮料等产品中；不同于其他无热量甜味剂，加热也不会影响三氯蔗糖的味道或结构，它几乎可以用于任何需要用糖的地方，包括烹调和焙烤中。世界卫生组织下的食品添加剂联合专家委员会经过多次环境和安全研究，在 1990 年确定三氯蔗糖的每日允许摄入量为每千克 15 毫克。美国制定的安全限量更低，是每天每公斤体重 5 毫克。对于一个60 公斤的成年人来说，一天的限量是 0.3 克。