护肝丸中护肝丸有效成分检测方案(液相色谱仪)

SSL-CA19-073Excellence in Science Excellence in ScienceLC-176 岛津企业管理(中国)有限公司分析中心Shimadzu(China)CO.，LTD. Analytical Applications Centerhttp：//www.shimadzu.com.cn上海市徐汇区宜州路180号B2栋咨询电话：021-34193996Hotline： 021-34193996 岛津 Nexera LC-40测定护肝丸有效成分含量 LC-176 摘要：本文采用岛津 Nexera LC-40高效液相色谱仪，建立了护肝丸有效成分含量的测定方法。方法采用1.8 um填料色谱柱进行分离，取得了良好的分离效果。连续6针进样，五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的保留时间和峰面积的 RSD 分别在 0.02%~0.12%和0.08%~0.17%之间，表明仪器精密度良好。按五味子乙素峰计理论塔板数为68692，满足药典中不应低于15000的要求。实验结果表明，该方法能快速准确地测定护肝丸中有效成分的含量。 关键词：Nexera LC-40 高效液相色谱仪护肝丸五味子 护肝丸由柴胡、茵陈、板蓝根、五味子、猪胆粉、绿豆制成，褐色至深褐色丸，味苦，涩。具有疏肝理气，健脾消食的功效。具有降低转氨酶作用。用于慢性肝炎及早期肝硬化。 《中国药典》2015年版中规定，使用高效液相色谱法对其有效成分含量进行测定，每1g成品中含五味子以五味子醇甲 (C24H3207)计，不得少于0.40 mg；以五味子甲素(C24H3206)计，不得少 于70 ug；以五味子乙素(C23H2806)计，不得少于0.20 mg；理论塔板数按五味子乙素峰计算应不低于15000。其中，五味子甲素和五味子乙素与杂质较难分离，常规 HPLC 法往往需要较长的分析时长来达到令人满意的分离度，却极大地降低了分析效率。本实验使用 Nexera LC-40 高效液相色谱仪，以1.8 um 填料色谱柱进行分离，建立了护肝丸有效成分含量的测定方法。 I实验部分 1.1仪器 本实验采用岛津 Nexera LC-40 液相色谱仪，包括 CBM-40A Lite 系统控制器， DGU-405脱气机， LC-40BXR输送泵，SIL-40C XR自动进样器，CTO-40S柱温箱，SPD-M40A检测器，LabSolutions Ver. 5.97色谱工作站。 图1岛津Nexera LC-40 高效液相色谱仪 1.2分析条件 色谱柱： UHPLC C18色谱柱(2.1mmi.d.×100 mm L， 1.8 um) 流动相：A，水；B，乙腈 流速：0.4mL/min柱温：45℃ 检测波长：250nm 进样体积：2p 洗脱方式：梯度洗脱，B相起始始度为20%，时间程序如表1所示。 表1梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 3.00 Pumps Pump B Conc. 45 15.00 Pumps Pump B Conc. 80 18.00 Pumps Pump B Conc. 80 18.10 Pumps Pump B Conc. 45 22.00 Controller Stop |样品前处理 对照品溶液制备：取五味子醇甲对照品、五味子甲素对照品和五味子乙素对照品适量，精密密定，加甲醇制成每1mL含五味子醇甲 80 ug、五味子甲素20 ug、五味子乙素 50 ug 的混合溶液，即得。(参照药典) 供试品溶液制备：取本品适量，粉碎，研开，取约1.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水饱和的乙酸乙酯25 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率500W，频率60 kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用乙酸乙酯补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10 mL，低温回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，准备上机。(参照药典) 结果与讨论 3.1标准溶液色谱图 按照1.2中分析条件，将2中配制的对照品溶液上机分析，色谱图如图1所示。《中国药典》要求理论塔板数按五味子乙素峰计算应不低于15000，本实验结果五味子乙素理论塔板数为68692，完全满足要求。 图1对照品溶液色谱图 3.2精密度实验 将配制得到的对照品溶液连续进样6次，考察仪器精密度。详见图2和表2. 图2对照品溶液6针重复性色谱图 表2对照品溶液重复性结果 五味子醇甲 五味子甲素 五味子乙素 保留时间 峰面积 保留时间 峰面积 保留时间 峰面积 1 3.719 723，089 11.388 168，890 12.540 379，973 2 3.707 721，574 11.391 168，552 12.539 379，189 3 3.706 719，159 11.389 168，475 12.535 377，909 4 3.712 721，354 11.395 168，673 12.542 379，234 5 3.711 721，438 11.393 168，759 12.540 379，422 6 3.710 720，620 11.393 168，591 12.540 379，292 RSD (%) 0.12 0.17 0.02 0.08 0.02 0.17 五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的保留时间和峰面积的 RSD 分别在 0.02%~0.12%和0.08%~0.17%之间，仪器精密度良好。新 Nexera 液相系统为良好的精密度提供硬件保障，LC-40B XR输送泵配备2台最大耐压 70 MPa 的泵单元，1台仪器即可实现延时短且精度高的高压梯度。柱塞一次冲程的送液量为10uL， 通过对其进行高速驱动，最大幅度降低流速脉动值和脉动产生周期，实现了前所未有的精确确输，浓度准确度的误差达到±0.5%以内。 SIL-40C XR自动进样器可实现低样品留留和微量进样的重复性。。可以使用2种清洗液清洗进样针外壁，以及进一步使用3种清洗液清洗进样针内壁和进样口，可在所有分析条件下减少样品残留，实验表明，残留控制在0.0003%以下。 3.3样品测定 将某厂家生产的护肝丸按照2中步骤得到供试品溶液，上机分析。色谱图如图3所示。连续测定6次，五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的保留时间和峰面积的 RSD 分别在0.03%~0.11%和0.25%~0.33%之间，仪器精密度良好。详见图4和表3。单点外标法定量，计算得到每1g样品中五味子醇甲含量为 537 ug， 五味子甲素为 120 ug， 五味子乙素为284 ug. 图3供试品溶液色谱图 uV 图4供试品溶液6针重复性色谱图 表3供试品溶液重复性结果 五味子醇甲 五味子甲素 五味子乙素 保留时间 峰面积 保留时间 峰面积 保留时间 峰面积 1 3.713 4，846，398 11.400 1，014，166 12.541 2，159，071 2 3.720 4，850，727 11.410 1，015，229 12.549 2，157，604 3 3.725 4，849，455 11.402 1，015，348 12.548 2，156，680 4 3.718 4，835，087 11.399 1，011，143 12.543 2，146，592 5 3.715 4，825，284 11.420 1，010，883 12.542 2，145，173 6 3.718 4，823，616 11.440 1，008，257 12.550 2，142，707 RSD (%) 0.11 0.25 0.13 0.28 0.03 0.33 I结论 本文采用岛津 Nexera LC-40 高效液相色谱仪，建立了护肝丸有效成分含量的测定方法。方法采用1.8 um 填料色谱柱进行分离，取得了良好的分离果果。连续6针进样，对照品中五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的保留时间和峰面积的 RSD 分别在0.02%~0.12%和0.08%~0.17%之间，表明仪器精密度良好。按五味子乙素峰计理论塔板数为68692，满足药典中不应低于15000的要求。使用此方法对某厂家生产的护肝丸进行分析，每1g样品中五味子醇甲含量为537 ug， 五味子甲素为120 ug， 五味子乙素为284 ug， 符合药典要求。实验结果表明，该方法能快速准确地测定护肝丸中有效成分的含量。 Building B2， No.180 Yizhou Road，Shanghai 《中国药典》2015年版中规定，使用高效液相色谱法对其有效成分含量进行测定，每1 g成品中含五味子以五味子醇甲（C24H32O7)计，不得少于0.40 mg；以五味子甲素（C24H32O6)计，不得少于70 μg；以五味子乙素（C23H28O6)计，不得少于0.20 mg；理论塔板数按五味子乙素峰计算应不低于15000。其中，五味子甲素和五味子乙素与杂质较难分离，常规HPLC法往往需要较长的分析时长来达到令人满意的分离度，却极大地降低了分析效率。本实验使用Nexera LC-40高效液相色谱仪，以1.8 µm填料色谱柱进行分离，建立了护肝丸有效成分含量的测定方法。