九味羌活丸中马兜铃酸I检测方案(液质联用仪)

SSL-CA20-370Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-508 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD. -Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cn Tel： 86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn LCMS-8040 分析中药九味羌活丸中的马兜铃酸1 LCMSMS-508 摘要：本文参考2020版《中国药典》九味羌活丸相关检查标准，建立了一种使用岛津高效液相色谱仪 LC-20A和三重四极杆质谱仪 LCMS-8040 联用测定九味羌活丸中马兜铃酸Ⅰ含量的方法。实验结果表明：在本系统条件下，空白溶剂对马兜铃酸检测无干扰；马兜铃酸Ⅰ在1~100 ng/mL浓度范围内线性关系良好，相关系数为0.9998；对20ng/mL的对照品溶液重复进样6针，保留时间和峰面积的 RSD 分别为 0.055%和2.90%，仪器精密度良好；6次加标回收实验中，马兜铃酸的平均回收率为 96.23%， RSD 为2.18%，方法准确度良好。该方法为采用 LC-MS/MS 方法检测马兜铃酸Ⅰ的检测人员提供很好的参考。 关键词：九味羌活丸LCMS-8040马兜铃酸 马兜铃酸主要存在于马兜铃科马兜铃属 Aristo-lochia 和细辛属Asarum 植物中，具有抗感染、抗癌、镇痛等药理作用，临床上被用于多系统多种疾病的治疗。同时，马兜铃酸也是一种具有致癌性和肾毒性的硝基菲类有机酸，其中以马兜铃酸Ⅰ的毒性最强。 《中国药典》自2005版起，已不再收录关木通、广防己、青木香等含马兜铃的中药方，细辛药用部位也将“全草”修改为“根和根茎”，原因是细辛地上部分马兜铃的含量较高。 《中国药典》2010年版进一步规定， 采用 HPLC 法检测细辛中的马兜铃酸Ⅰ含量不得超过0.001%。 《中国药典》2020版首次规定采用 LC-MS/MS法检测九味羌活丸中的马兜铃酸I，该处方中含有细辛药材，并规定1g九味羌活丸中马兜铃酸Ⅰ的含量不得过 500 ng。 本文参考《中国药典》2020版《九味羌活丸》标准，利用岛津高效液相色谱仪LC-20A 和三重四极杆质谱仪LCMS-8040联用，建立九味羌活丸中马兜铃酸Ⅰ的检测方法，供相关检测人员参考。 实验部分 1.1仪器 本实验使用高效液相色谱仪 LC-20A与三重四极杆质谱仪 LCMS-8040 联用系统，具体配置为： 系统控制器： CBM-20A脱气机： DGU-20A输液泵： LC-20ADXR×2自动进样器：SIL-20AC XR柱温箱： CTO-20AC色谱工作站： LabSolutions Ver. 5.91 1.2分析条件 液相条件 色谱柱： Shim-pack Velox (50 mm×2.1 mml.D.， 1.8 um)， PN： 227-32007-02，岛津(上海)实验器材有限公司 流动相：A相-0.1%FA水溶液，B相-乙腈 流速： 0.3mL/min 柱温：30℃ 进样量：1pL 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为35%，洗脱程序见表1。 表1 洗脱程序 Time(min) Module Command Value 10 Pumps Pump B Conc. 38 10.1 Pumps Pump B Conc. 35 13 Controller Stop 质谱条件 离子化模式：ESI* 碰撞气：氩气 雾化气：氮气3.0 L/min DL温度：150℃ 干燥气：氮气10.0L/min 加热模块温度：400℃ 接口电压：3kV 离子源位置：+2mm 驻留时间：200ms 扫描模式：多反应监测(MRM) 表2 MRM 参数 序号 化合物 CAS No. 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias (V) CE (V) Q3 Pre Bias (V) 1 313-67-7 359.10 296.10* -13.00 -13.00 -29.00 马兜铃酸Ⅰ 298.00 -10.00 -12.00 -30.00 *表示定量离子 1.3样品前处理 (1)供试品溶液：取市售九味羌活丸适量，研细，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25mL，密塞，称定重量，超声起理(功率250W， 频率 40 kHz) 30分钟，取出，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。 (2)标准工作液：取马兜铃酸|对照品适量，精密称定，加70%甲醇溶解并制成每1mL含25ug的溶液，作为标准储备液。精密量取标准储备液适量，加70%甲醇稀释制成释1mL各含1、2、5、10、20、50、100 ng的溶液作为标准工作液。 结果与讨论 2.1标准样品定量定性通道 MRM 色谱图 图 1L.20ng/mL标准样品 MRM色谱图(左图为定量离子) 2.2专属性实验 对空白溶剂进行分析，目标峰保留时间处，无干扰，如图2所示. 图22空白色谱图 2.3线性范围 将浓度为1、2、5、10、20、50、100 ng/mL标准工作液，按1.2中的分析条件上机分析，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，外标法建立校准曲线，结果如图3所示，线性方程、线性范围和相关系数见表3. 图3校准曲线 表3 校准曲线参数 名称 校准曲线 线性范围((ng/mL) 相关系数R 准确度(%) 马兜铃酸I Y=(1558.948)X+(-240.5136) 1~100 0.9998 97.0~101.1 2.4精密度实验 对浓度为20 ng/mL的标准溶液连续测定6次，考察仪器的精密度，结果如表4所示，保留时间和峰面积的 RSD 分别味 0.055%和2.90%，仪器精密度良好。 表4精密度测试结果 项目 保留时间(min) 峰面积 1 3.557 28171 2 3.560 29947 3 3.563 28851 4 3.561 30553 5 3.559 29454 6 3.561 28890 RSD(%) 0.055 2.90 2.5样品测定 取供试品溶液按1.2中的分析条件上机分析，供试品中检出马兜铃酸Ⅰ，以外标法定量计算马兜铃酸Ⅰ的浓度为 5.294 ng/mL， 含量为 132.35 ug/g。根据《中国药典》2020版对九味羌活丸中马兜铃酸Ⅰ的含量要求，供试品溶液中 m/z 359.0→298.0和 m/z 359.0→296.0两个通道的色谱峰应小于 20 ng/mL对照品色谱峰。本品结果符合药典规定，色谱图如图4所示。 图4供试品及限度对照品色谱图(红色：供试品，黑色：对照品20 ng/mL) 2.6加标回收率实验 取本品细粉6份，精密称定，分别精密加入马兜铃酸I对照品溶液适量，按1.3方法进行前处理，考察回收率，回收率如表6所示。 表6加标回收率考察 序号 样品中含量 (ng) 130.44 加标量(ng) 实测值 (ng) 回收率(%) 平均回收率 ±RSD(%) 1 250.00 366.65 96.38 96.23±2.18 2 133.71 250.00 371.33 96.77 3 132.15 250.00 374.35 97.96 4 130.68 250.00 375.60 98.67 5 144.55 250.00 372.98 94.53 6 142.41 250.00 365.25 93.08 结论 本文参考2020版《中国药典》九味羌活丸相关检查标准，建立了一种使用岛津高效液相色谱仪 LC-20A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8040联用测定九味羌活丸中马兜铃酸Ⅰ含量的方法。该方法具有专属性强、灵敏度高、重复性好的特点，满足2020版《中国药典》九味羌活丸马兜铃酸Ⅰ的检查需求。 岛津应用云 本文参考2020版《中国药典》九味羌活丸相关检查标准，建立了一种使用岛津高效液相色谱仪LC-20A和三重四极杆质谱仪LCMS-8040联用测定九味羌活丸中马兜铃酸I含量的方法。实验结果表明：在本系统条件下，空白溶剂对马兜铃酸I检测无干扰；马兜铃酸I在1~100 ng/mL浓度范围内线性关系良好，相关系数为0.9998；对20 ng/mL的对照品溶液重复进样6针，保留时间和峰面积的RSD分别为0.055%和2.90%，仪器精密度良好；6次加标回收实验中，马兜铃酸I的平均回收率为96.23%，RSD为2.18%，方法准确度良好。该方法为采用LC-MS/MS方法检测马兜铃酸I的检测人员提供很好的参考。