金鸡颗粒中毛两面针素检测方案(液质联用仪)

SSL-CA20-382Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-515 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD. - Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cnTel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn 金鸡颗粒中毛两面针素的定性测定 LCMSMS-515 摘要：本文采用岛津 LC-20ADXR 高效液相色谱系统、LCMS-8040 高效液相色谱串联质谱系统，建立了金鸡颗粒中毛两面针素的定性方法。金鸡颗粒经70%乙醇提取， Shim-pack GIST C18色谱柱分离，未检出毛两面针素；金鸡颗粒加标样品在 RT=33.4 min 检出色谱峰(330 nm)，经与毛两面针素光谱图(190-400nm)比较，初步识别为毛两面针素。采用 LCMS-8040 对目标峰进行分析， SCAN+触发产物离子扫描模式，目标峰与毛两面针素一级、、二二级质谱图相似度极高，判断目标峰为毛两面针素。本文建立了基于液相色谱、UV光谱以及串联质谱的金鸡颗粒掺伪毛两面针的鉴别方法，该方法选择性强，灵敏度高，有效保障了临床用药安全。 关键词：LC-20ADXR LCMS-8040 两面针毛两面针上毛两面针素 掺伪 两面针，为芸香科植物两面针的干燥根，具有活血化瘀，行气止痛的功效。然而，市售大多数商品药材为毛两面针，不符合药典要求。已有研究表明，两面针与毛两面针药材成分差异较大，不适合替代使用。两面针主要含有乙氧基白屈菜红碱和氯化两面针碱成分，少数含有橙皮苷，毛两面针中木兰花碱，橙皮苷的含量均较高，毛两面针素为特有成分。 两面针素检查项补充检验方法》，对金鸡颗粒中使用毛两面针进行规定。根据保留时间、PDA光谱图、以及质谱图等信息对毛两面针素进行定性识别。 本文，参考《金鸡颗粒中毛两面针素检查项补充检验方法》，建立了金鸡颗粒中添加毛两面针的定性测定方法。该方法综合考虑色谱分离、UV光谱以及质谱定性要素，选择性强，灵敏度高，供相关行业参考。 2020年2月，国家药监局发布了《金鸡颗粒中毛 实验部分 1.1仪器 岛津 LCMS-8040超高效液相色谱-串联质谱系统，配备 PDA 检测器。具体配置如下 输液泵：LC-20ADXR×2 系统控制器：CBM-20A自动进样器：SIL-20AC 三重四极杆质谱仪：LCMS-8040柱温箱：CTO-20AC 色谱工作站：LabSolutions Ver. 5.98 在线脱气机：DGU-20As 二极管阵列检测器：SPD-M20A 1.2分析条件 1.2.1液相色谱条件 色谱柱： Shim-pack GIST C18 色谱柱(250 mm× 4.6 mm l.D.， 5um)，岛津(上海)实验器材有限公司P/N227-30017-08 流动相：A-0.1%磷酸水溶液；B-乙腈 流速：1mL/min 柱温：40℃进样体积：10 uL波长：330nm 洗脱方式：等度洗脱，B相浓度为21% 1.2.2液相色谱-质谱联用条件 液相条件 色谱柱： Shim-pack GIST C18 色谱柱(250 mm× 4.6 mm l.D.， 5 um)，，岛津(上海)实验器材有限公司P/N 227-30017-08 流动相： A-10mM乙酸铵溶液；B-乙腈 流速： 1mL/min柱温：40℃C进样体体： 10uL进样方式：柱后三通分流，约30%进质谱 洗脱方式：等度洗脱，B相浓度为21% 质谱条件 离子源参数 离子源： ESI* 加热模块温度：400℃ 雾化气流速：3.0 L/min 干燥气流速：15.0L/min DL温度：250℃ 扫描模式：MS SCAN/触发产物离子扫描 MS参数：扫描范围m/z100-500，触发产物离子，优选离子 m/z 309.1，CE=-35V 1.3对照品溶液配制 精密称取毛两面针素标准品2.5 mg， 用1.0mL乙醇溶解，并稀释至 30 ug/mL工作液，待测。 1.4供试品制备 取金鸡颗粒适量，研细，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇20ml， 密塞，称定重量，超声处理40分钟，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。 1.5结果判断 供试品色谱中，应不得出现与对照品色谱保留时间相同的色谱峰。若出现保留时间相同的色谱峰，则采用二级管阵列检测器比较相应色谱峰的紫外-可见吸收光谱，吸收光谱应不相同。必要时采用高效液相色谱-质谱联用方法确证。建议使用乙腈 -0.01mol/L 乙酸铵溶液流动相系统。 (源自《金鸡颗粒中毛两面针素检查项补充检验方法》，国家药品监督管理局，2020年2月)。 结果与讨论 2.1色谱图 对照品进行分析，毛两面针素保留时间 RT=33.4 min， 理论塔板数16428，大于3000，系统适应性通过。对照品、供试品、供试品加标进行分析，如下图1，供试品中未检出毛两面针素，，而供试品加标样品可检出毛两面针素，初步判定金鸡颗粒中无毛两面针，结果符合预期。 图11对照品、供试品、供试品加标色谱图 2.2检出限及定量限 对浓度为30 ug/mL 的毛两面针杉溶液进样分析，由信噪比计算其检出限及定量限 (LOD，S/N=3； LOQ， S/N=10)，结果如表1所示。 表1 毛两面针素的检出限和定量限 名称 检出限(ug/mL) 定量限(ug/mL) 毛两面针素 0.09 0.27 2.3光谱图相似度判别 供试品加标样品中毛两面针素与对照品的保留时间一致，保留时间 RSD<2%。对照品、供试品加标样品在RT=32.9 min 色谱峰，在190-400 nm 波长范围内的紫外光谱图见图2，其光谱相似度为92.2%(图8)。 图2供试品、供试品加标样品光谱图 (RT=32.9 min) ID# 显示 对象 对象参数 比例 缩放倍车 Amax 入min 相似度 Ch# 1 光谱 毛两面针素 UV光谱.jcm 设置 1.0 205/329/484/655/626 262/406/620/671/647 Ref 2 时间 32.95615 设置 1.0 205/224/328/766/663 199/219/265/643/670 0.9216 1 图3光谱相似度对比结果 2.4液相色谱质谱联用方法确证结果 为了进一步进行定性确认，使用 LCMS-8040 对 RT=33.4 min 色谱峰进行分析。在使用液质联用分析时，选择10mM乙酸铵作为水相，并进行柱后分流进样，以保证质谱的离子化效率。对照品中毛两面针素质谱图如下图4，观测到正离子模式[M+H]+峰， m/z 309.05，对前体离子进行碰撞，碰撞能 CE=-35V，二级质谱图登录 MSn库。金鸡颗粒样品加标样品在 RT=33.4 min 色谱峰检出色谱峰，一级质谱图基峰为 m/z 309.00，二级质谱图进行谱库检索，与毛两面针素相似度99分(满分100)，主要碎片离子 m/z 235.00、 m/z 219.00、m/z205.00、m/z 191.00均与毛两面针素碎片离子一致，如图5所示。以上结果表明，串联质谱用于毛两面针素定性选择性强，重现性好。 图4对照品中毛两面针素一级提取离子流图(EIC)、、一级质谱图(MS1)、二级质谱图 (MS2) (MSn)库搜索结果 × 报告(R)视图(V)化合物信息(C)质谱(S)帮助(H) 图5加标样品二级质谱图谱库检索结果 结论 本文采用岛津 LC-20ADXR高效液相色谱系统、LCMS-8040 高效液相色谱质谱系统，建立了金鸡颗粒中违规添加毛两面针的定性识别方法。该方法基于色谱保留时间、UV光谱以及一级、二级质谱图定性，选择性强，准确度高，供相关行业参考。 岛津应用云 本文采用岛津LC-20ADXR高效液相色谱系统、LCMS-8040高效液相色谱串联质谱系统，建立了金鸡颗粒中毛两面针素的定性方法。金鸡颗粒经70%乙醇提取，Shim-pack   GIST C18色谱柱分离，未检出毛两面针素；金鸡颗粒加标样品在RT=33.4 min检出色谱峰（330   nm），经与毛两面针素光谱图（190-400nm）比较，初步识别为毛两面针素。采用LCMS-8040对目标峰进行分析，SCAN+触发产物离子扫描模式，目标峰与毛两面针素一级、二级质谱图相似度极高，判断目标峰为毛两面针素。本文建立了基于液相色谱、UV光谱以及串联质谱的金鸡颗粒掺伪毛两面针的鉴别方法，该方法选择性强，灵敏度高，有效保障了临床用药安全。