医药中黄曲霉毒素检测方案(氨基酸分析仪)

SSL-CA22-085Excellence in Science Excellence in ScienceLC-283 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD. -Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cn Tel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn 高效液相色谱光化学衍生法用于黄曲霉毒素的分析 LC-283 摘要：本文建立了采用岛津 Essentia LC-16 高效液相色谱柱后光化学衍生法检测黄曲霉毒素的方法，并对 方法的线性、准确性、重现性进行了考察。结果表明，黄曲霉毒素B1、G1标准工作液线性范围是3~5 pg，B2、G2标准工作液线性范围是10~50 pg， 相关系数R均大于0.9997，线性良好。黄曲霉毒素B1、G1、 B2、G2定量限和检测限满足药典要求。对标准品连续6次进样，各组分的保留时间 RSD%<0.3%，峰面积RSD%<2.0%，仪器精密度良好。 关键词：LC-16 光化学衍生黄曲霉毒素 黄曲霉毒素 (afLatoxin， AFT) 是一组具有强毒性和致癌性的次级真菌代谢产物，主要有B1、B2、G1和G2，其中B1毒性最大。目前2020年版《中国药典》黄曲霉毒素测定法主要有液相色谱法、液相色谱-串联质谱法、酶联免疫法。中国药典质量标准中规定每1000g含黄曲霉毒素Bl不得过5 ug， 含黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素B2和黄曲霉毒素B1的总量不得过10 ug。 由于黄曲霉毒素在水溶液中会发生荧光淬灭，反相色谱中检测黄曲霉毒素B1和G1两种异构体荧光强度很弱，需进行衍生化。衍生化的方法一般有柱前和 柱后两类，柱前衍生一般使用三氟乙酸，柱后衍生有碘液、过溴化吡啶溴以及电化学和光化学衍生等方法。 2020年版《中国药典》2351真菌毒素测定法之黄曲霉毒素测定法第一法，即液相色谱法，该法分为碘衍生法和光化学衍生法，均为柱后衍生法。光化学衍生无需配制衍生化试剂和额外的输液泵，也无需电化学衍生器，操作较为简便，成本较低。 本实验采用岛津高效液相色谱 Essentia LC-16 柱后光化学衍生系统建立了黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2的检测方法，该方法能准确地进行黄曲霉毒素分析，且灵敏度符合药典要求，供相关检测人员参考。 实验部分 1.1仪器 本实验使用岛津 Essentia LC-16高效液相色谱仪，具体配置如下： 系统控制器： CBM-20Alite 自动进样器： SIL-16 柱 温 箱 ： C T O - 1 6 L 输液泵：LC-16 脱气机： DGU-20A。 检测器： RF-20A 色谱工作站： LabSolutions Essentia Ver. 5.106 1.2分析条件 色谱柱： InertsiL ODS-3 (150mmLX4.6 mmI.D.， 5 um) 检测波长：激发波长360 nm；发射波长450 nm 流速：1mL/min 柱温：35℃ 洗脱方式：等度洗脱 流动相：甲醇/乙腈/水=40/18/42(V/V/V) 衍生波长：254nm 光衍生器： PriboLab@(光化学衍生反应器) 1.3混合对照品溶液的制备 精密量取黄曲霉毒素混合对照品溶液(黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素 G1 和黄曲霉毒素G2，浓度分别为 1.0 ug/mL、0.3 ug/mL、1.0 ug/mL、0.3 ug/mL) 0.5mL，置10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为贮备溶液。 精密量取贮备溶液1mL， 置25mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。 结果与讨论 2.1标准样品色谱图 光化学衍化法混合对照品溶液色谱图如图1所示。其中， AFG1、AFB1浓度为 2.0 ng/mL， AFG2、AFB2浓度为0.6ng/mL， 分离度满足药典要求。 图1黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标准样品色谱图((进样量5uL) 2.2线性范围 光化学衍生条件下，混合对照溶液 (AFG1、AFB1浓度为2.0 ng/mL， AFG2、AFB2浓度为 0.6 ng/mL) 分别进样5 pL、10uL15uL、20uL、25pL。按照中国药典要求，以进样量(pg) 为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制校准曲线，线性关系情况和实测定量限检测限结果见表1，校准曲线见图2。由结果可见， AFB1、AFB2、AFG1、AFG2 校准曲线线性良好，定量限和检测限满足药典要求。 图2校准曲线 表1光化学衍生法线性关系结果 # 组分 线性方程 线性范围 (pg) 相关系数 准确度(%) LOQ(pg) LOD(pg) 1 AFG2 Y=(41187.4)X+ (439.331) 10-50 0.99994 99.2-100.8 0.66 0.20 2 AFG1 Y=(16328.8)X+(350.115) 3-15 0.99996 98.1-100.9 1.97 0.57 3 AFB2 Y=(65587.0)X+ (934.706) 10-50 0.99977 98.3-102.1 0.52 0.16 4 AFB1 Y=(31717.7)X+(1182.91) 3-15 0.99995 99.5-101.0 1.28 0.38 2.3重复性 在光化学衍生条件下，混合对照品溶液 (G1、、B1浓度为2.0 ng/mL， G2、B2浓度为 0.6 ng/mL)各取10uL连续进样6次，考察仪器精密度，结果如表4，各组分的保留时间 RSD%<0.3%，峰面积RSD%<2.0%，仪器精密度良好。 表4 重复性结果 # 组分 保留时间RSD(%) 峰面积RSD(%) 1 AFG2 0.242 0.742 2 AFG1 0.250 0.819 3 AFB2 0.256 1.019 4 AFB1 0.262 0.926 结论 本文建立了采用岛津 Essentia LC-16高效液相色谱柱后光化学衍生法检测黄曲霉毒素的方法，并对方法的线性、准确性、重现性进行了考察。结果表明，黄曲霉毒素B1、G1标准工作液线性范围是3~5 pg， B2、G2标准工作液线性范围是 10~50 pg，相关系数R均大于0.9997，线性良好。黄曲霉毒素B1、G1、B2、G2定量限和检测限满足药典要求。对标准品连续6次进样，各组分的保留时间 RSD%<0.3%，峰面积 RSD%<2.0%，仪器精密度良好。 岛津应用云 本文建立了采用岛津Essentia LC-16高效液相色谱柱后光化学衍生法检测黄曲霉毒素的方法，并对方法的线性、准确性、重现性进行了考察。结果表明，黄曲霉毒素B1、G1标准工作液线性范围是3~5pg，B2、G2标准工作液线性范围是10~50 pg，相关系数R均大于0.9997，线性良好。黄曲霉毒素B1、G1、B2、G2定量限和检测限满足药典要求。对标准品连续6次进样，各组分的保留时间RSD%<0.3％，峰面积RSD%<2.0 %，仪器精密度良好。