本法采用柱切换液相色谱法。柱切换液相色谱法是将同种色谱不同选择性分离柱组合,构成联用系统的技术。柱切换液相色谱系统通常由第一维分离柱和第二维分离柱串联组成,两柱之间通过切换阀作为接口,以改变流动相流路,将部分或全部第一维柱流出的组分,导入第二维柱进行二次分离,从而起到净化目标化合物,提高系统分离能力的作用;对于药品制剂中的油脂和待测前维生素D和维生素D的分离有很好的作用。
SSL-CA20-090Excellence in Science Excellence in ScienceLC-200 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co., LTD.-Analytical Applications CenterTel:86(21)34193996Email: sshzyan@shimadzu.com.cnhttp://www.shimadzu.com.cn 中心切割二维液相法测定药品中维生素D含量 LC-200 摘要:本文建立了符合《中国药典》2020年版四部通则《0722维生素D测定法》中第四法维生素D含量测定的方法。为了解决前维生素D受杂质干扰的问题,采用岛津中心切割二维液相色谱系统进行测试;在指定的二维液相色谱条件下,对照品前维生素D和维生素D在第一维液相和第二维液相中出峰良好,分离度满足要求。取对照品重复进样测试,保留时间 RSD 为 0.26%~0.71%,峰面积RSD 为0.76%~1.46%;虽然维生素D制剂供试品溶液前维生素D在第一维色谱中受杂质干扰,但在第二维色谱中成功将前维生素D与杂质分离;第一维液相色谱中维生素D理论塔板数为2511~2706,前维生素D和维生素D的分离度均大于5,第二维液相色谱中前维生素D和维生素D附近均无明显干扰峰,以上结果均符合药典系统适用性要求。结果表明,该方法有效、可靠,可以应对《中国药典》2020年版四部通则《0722维生素D测定法》中第四法中维生素D含量的测定。 关键词:维生素D)中心切割二维液相色谱中国药典2020年版 维生素D是一种脂溶性维生素,其具有促进生长和骨骼钙化,促进牙齿健全、用于治疗佝偻病、骨软化症等功能作用。维生素D实际上是一种激素原,本身无活性,需先在肝脏和肾脏中经过代谢后才有活性。2019年5月24日,国家药典委员会发出“关于《中国药典》2020年版四部通则增修订内容(第十二批)的公示”《0722维生素D测定法(第一次征求意见稿)》。该征求意见稿中包含四法,均用高效液相色谱法(通则0512)测定维生素D(包括维生素D2和维生素D3)及其制剂、维生素AD 制剂或鱼肝油中所含维生素D及前维生素D经折算成维生素D的总量。当待测药品中无维生素A及其他杂质干扰可用第一法测定,否则应按第二法处理后测定;如果按第二法处 实验部分 理后,前维生素D峰仍受杂质干扰,仅有维生素D峰可以分离时,则应按第三法测定;或不经前处理按第四法测定。 其中, 《0722维生素D测定法》中维生素D测定法新增的第四法为柱切换液相色谱法。柱切换液相色谱法是将同种色谱不同选择性分离柱组合,构成联用系统的技术。柱切换液相色谱系统通常由第一维分离柱和第二维分离柱串联组成,两柱之间通过切换阀作为接口,以改变流动相流路,将部分或全部第一维柱流出的组分,导入第二维柱进行二次分离,从而起到净化目标化合物,提高系统分离能力的作用。 本文采用岛津中心切割二维液相色谱仪,参照中国药典给出的柱切换色谱法建立了相对应的检测方法。 1.1仪器 岛津中心切割二维液相系统。具体配置为: LC-20AD×3(输液泵), DGU-20A3R(在线脱气机), SIL-20AC(自动进样器), CTO-20AC(柱温箱),, FCV-12AH 高压流路选择阀, SPD-20A 紫外检测器, SPD-M20A 二极管阵列检测器, CBM-20A系统控制器。 图1 岛津二维液相(中心切割)系统 1.2分析条件 第一维色谱柱: AcclaimTM HILIC-10 (2.1x150mm, 3 um) 第二维色谱柱: ZORBAX RX-SIL (3.0x100mm, 1.8um) 第一维流动相:A相:正己烷;B相:正己烷-正戊烷-异丙醇 (98:1:1);;按下表程序进行梯度洗脱 表1 梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 0.00 泵 Pump B.Conc 5 15.30 柱温箱 CTO.RVR 0 18.30 柱温箱 CTO.RVR 21.50 柱温箱 CTO.RVR 0 27.50 柱温箱 CTO.RVR 30.00 泵 Pump B.Conc 5 35.00 泵 Pump B.Conc 100 60.00 泵 Pump B.Conc 100 65.00 泵 Pump B.Conc 5 80.00 泵 Pump B.Conc 5 第二维流动相:正己烷-正戊醇-异丙醇(996:2:2),等度洗脱 流速: 0.5mL/min 柱温:40℃ 进样体积:100uL 检测波长:265nm 收集管:聚醚醚酮(peek) 管,内径0.0762 cm(0.03英寸),20m, 容积约9mL 1.3对照品溶液和样品溶液的制备 按照《中国药典》2020年版四部通则0722维生素D 测定法第四法要求进行制备。 实验结果 2.1维生素D分析色谱图 采用1.2项分析条件,取 0.5 ug/mL对照品溶液进样分析;图2和图3分别展示了维生素D和前维生素D的第一维和第二维色谱图。 图2 前维生素D和维生素D校正因子f2对照品溶液第一维色谱图 图3 前维生素D和维生素D校正因子f2对照品溶液第二维色谱图 2.2重复性结果 按照中国药典的要求,对照品重复进样峰面积 RSD 应低于2%。取对照品溶液0.5 ug/mL重复进样5次,得到的保留时间和峰面积RSD 如表2所示。各化合物保留时间 RSD 为 0.26%~0.71%,峰面积RSD为0.76%~1.46%,均符合药典的要求。 表2重复性考察结果(n=5) 化合物 保留时间(min) 峰面积 化合物 保留时间(min) 峰面积 17.129 28,468 25.126 204869 17.169 28,630 25.248 208488 前维生素D 16.927 27,790 维生素D 24.881 202582 (第一维) 17.172 28,092 (第一维) 25.278 200455 17.225 28,005 25.326 203986 0.67 1.22 0.71 1.46 RSD/% 0.67 1.22 RSD/% 0.71 1.46 44.715 25,079 58.858 197946 44.802 25,023 58.822 197713 前维生素 D (第二维) 44.533 25,477 维生素D 58.627 202929 (第二维) 44.791 25,346 58.646 195464 44.855 25,338 58.984 196356 RSD/% 0.28 0.76 RSD/% 0.26 1.46 2.3供试品溶液结果考察 取某品牌维生素D制剂,平行两份,采用1.3方法制备成供试品溶液,上机分析,每份供试品重复进样两次,所得供试品溶液色谱图如图4、图5所示。其中第一维色谱图中前维生素D峰被油脂包裹,切入至第二维色谱后,前维生素D和维生素D和杂质峰均得到有效分离。表3列出了供试品溶液的测试结果,峰面积重复性良好。 图4 前维生素D和维生素D供试品溶液第一维色谱图 图5 前维生素D和维生素D供试品溶液第二维色谱图 表3供试品溶液平行测定结果 重复次数 第一维色谱 第二维色谱 前维生素D 维生素 D 前维生素D 维生素D 1-1 一 268464 11595 264553 供试品溶液 峰面积 1-2 274789 10785 268909 2-1 255715 10477 259241 2-2 262550 11446 260512 2.4系统适用性结果考察 药典对前维生素D、维生素D的分离度、理论塔板数等系统适用性参数作了要求。采用本方法对药典方法中的要求――进行考察,结果见表4。结果表明本方法实验结果符合药典标准要求。 表4 系统适用性考察结果 标准要求项目 标准要求 本方法结果 系统适用性-理论塔板数 第一维液相,理论板数按维生素D峰计算 连续进样5针理论塔板数为2511~2706, 应不低于2300 满足要求。 系统适用性-分离度 第一维液相色谱系统中前维生素D峰与维 生素D的分离度应不小于5 连续进样5针,采用EP方法计算,分离度 为5.122~5.239,满足要求。 第二维液相色谱系统中维生素D峰与相邻 对照品溶液和供试品溶液中第二维色谱图 系统适用性-分离度 峰的分离度以及前维生素D峰和相邻峰的 分离度均应符合规定(一般大于1.5) 维生素D和前维生素D附近无明显干扰峰。 系统适用性-重复性 0512要求一般应小于2.0% 第一维、第二维前维生素D、维生素D5针重复进样 RSD 为 0.76%~1.46%,符合要求 结论 采用岛津中心切割二维液相色谱系统,参考《中国药典》2020年版四部通则《0722维生素D测定法》中第四法维生素D含量测定的方法,对维生素D含量进行检测,结果表明对照品溶液前维生素D和维生素D在第一维色谱和第二维色谱中均分离良好;配制0.5 ug/mL对照品溶液重复进样5次,前维生素D和维生素D在第一维和第二维系统中保留时间与峰面积 RSD 均低于2%;维生素D制剂供试品溶液第一维色谱前维生素D与杂质难以分离,但切入第二维色谱后分离良好;其余系统适用性测试结果也均符合中国药典要求。结果表明,所建立的方法适用于应对《中国药典》2020年版四部通则《0722维生素D测定法》中第四法中维生素D含量的测定。 岛津应用云 本文建立了符合《中国药典》2020年版四部通则《0722 维生素D测定法》中第四法维生素D含量测定的方法。为了解决前维生素D受杂质干扰的问题,采用岛津中心切割二维液相色谱系统进行测试;在指定的二维液相色谱条件下,对照品前维生素D和维生素D在第一维液相和第二维液相中出峰良好,分离度满足要求。取对照品重复进样测试,保留时间RSD为0.26%~0.71%,峰面积RSD为0.76%~1.46%;虽然维生素D制剂供试品溶液前维生素D在第一维色谱中受杂质干扰,但在第二维色谱中成功将前维生素D与杂质分离;第一维液相色谱中维生素D理论塔板数为2511~2706,前维生素D和维生素D的分离度均大于5,第二维液相色谱中前维生素D和维生素D附近均无明显干扰峰,以上结果均符合药典系统适用性要求。结果表明,该方法有效、可靠,可以应对《中国药典》2020年版四部通则《0722 维生素D测定法》中第四法中维生素D含量的测定。
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