辛芩颗粒制剂中马兜铃酸检测方案(液质联用仪)

SSL-CA20-405Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-521 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.- Analytical Applications CenterTel：86(21)34193996Email： sshzyan@shimadzu.com.cnhttp：//www.shimadzu.com.cn LCMS-8050 测定辛芩颗粒制剂中4种马兜铃酸 LCMSMS-521 摘要：本文使用岛津三重四极杆液相色谱质谱联用仪 (LCMS-8050) 开发了辛芩颗粒制剂中4种马兜铃酸的检测方法。实验结果表明，在0.05-100ng/mL浓度范围内，方法线性良好，线性相关系数在0.9995-0.9999 之间。曲线各标点准确度在90.8-111.6%之间。1 ng/mL标准溶液连续进样6次，保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD%)分别在 0.04-0.06%和1.5-2.8%之间，方法精密度良好。0.025 mg/kg、0.5 mg/kg 和2.5 mg/kg三个不同浓度加标回收率在90.7-103.4%之间，平行三份样品的相对标准偏差(RSD%)在1.5-4.3%之间。该方法简单、方便、准确，适用于辛芩颗粒制剂中马兜铃酸的检测。 马兜铃酸类化合物(aristolochic acids， AA) 是马兜铃科马兜铃属植物特有的一类硝基菲类化合物，包括马兜铃酸A、B、C、D等，其中马兜铃酸A为主要毒性成分。近几年，临床不断出现含马兜铃酸类成分的药品引起肾脏损害的病例，国内外期刊也相继发表了含马兜铃酸药品使用安全性的评论。美国食品药品管理局(FDA)在2000年5月禁止了包括关木通、马兜铃、青木香、天仙藤、广防己、木防己等同名异物、异名同物品种的相关草药和中成药的进口和销售。我 国也采取了一系列风险防控措施，其中包括取消关木通、广防己和青木香的药用标准，并分别用木通、防己和土木香替代使用等。 细辛属马兜铃科植物，由于辛芩制剂中含有该药材，因此很有必要对辛芩制剂中马兜铃酸类化合物含量进行监测，为国家药品质量标准准提高提供依据。本文采用岛津三重四极杆液质联用仪 LCMS-8050，建立了辛芩颗粒制剂中4种马兜铃酸的分析方法，供相关检测人员参考。 本实验使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 与三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 联用系统，具体配置为： 系统控制器：CBM-20A 脱气机：DGU-20As 输液泵： LC-30AD×2自动进样器：SIL-30ACMP柱温箱： CTO-30A色谱工作站： LabSolutions Ver. 5.99 1.2分析条件 液相条件 色谱柱： Shim-pack Velox C18 (100 mm × 2.1 mm l.D.， 2.7um， P/N：227-32009-03，岛津(上海))实验器材有限公司) 流动相：A相-(0.1%甲酸，1 mmol/L乙酸铵)水；B相-甲醇 流速：0.3mL/min 柱温：30℃ 进样器温度：15℃ 进样量：2uL 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为50%，洗脱程序见表1。 表1 梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 6.00 Pumps Pump B Conc. 70 7.00 Pumps Pump B Conc. 95 8.00 Pumps Pump B Conc. 95 8.10 Pumps Pump B Conc. 50 11.00 Controller Stop LCMS-8050 质谱条件： 离子源： ESI，正离子模式加热模块温度：400℃雾化气：氮气3.0 L/min接口温度：300℃干燥气：氮气10.0 L/min扫描模式：多反应监测(MRM)加热气：空气10.0 L/minMRM参数：见表2 DL管温度：200℃ 2MRM 参数 No. 名称 CAS 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias(V) CE(V) Q3 Pre Bias(V) 1 359.05 298.00* -26.0 -13.0 -20.0 马兜铃酸 A 313-67-7 296.00 -26.0 -14.0 -30.0 268.15* -16.0 -13.0 -18.0 2 马兜铃酸B 475-80-9 329.05 294.10 -24.0 -13.0 -29.0 3 马兜铃酸C 4849-90-5 345.00 282.05* -26.0 -13.0 -13.0 284.05 -13.0 -13.0 -19.0 4 马兜铃内酰胺 13395-02-3 294.05 279.10* -11.0 -27.0 -28.0 251.05 -21.0 -35.0 -26.0 注：*表示定量离子 1.3准准品溶液制备 马兜铃酸混合标准储备液：精密称取4种马兜铃酸标准品各10 mg，用甲醇定容至100 mL容量瓶中，制得100 pg/mL标准储备液。 马兜铃酸混合标准系列工作溶液：从上述储备液中移取备量，用空白基质配制成 0.05 ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL标准系列工作溶液。 1.4样品前处理 准确称取1g试样至50mL离心管中，加入70%甲醇25mL，涡旋混匀2分钟，超声处理30 min，取出，放冷，以10000转/分的速率离心10分钟，将上清液过 0.22 m 滤膜过滤，取滤液上机。 结果与讨论 2.1标准品溶液色谱图 图14种马兜铃酸酒准品溶液(0.5ng/mL) MRM色谱图 2.2线性范围 将1.3中制备的0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100 ng/mL 标准系列工作溶液，取2uL进样，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，使用外标法拟合工作曲线。标准曲线线图2。各浓度点线性回归的准确度、判定系数R等结果见表3. 图244种马兜铃酸工作曲线 表3 校准曲线信息 化合物 线性范围 (ng/mL) 准确度(%) 判定系数R 马兜铃酸A 0.05-100 96.3-111.3 0.9998 马兜铃酸B 0.05-100 93.3-111.6 0.9999 马兜铃酸 C 0.05-100 95.6-108.4 0.9995 马兜铃内酰胺 0.05-100 90.8-111.0 0.9999 2.3重复性考察 1 ng/mL 浓度对照品溶液，连续进样6次，考察保留时间和峰面积的重复性，结果如下表4所示。保留时间和峰面积的相对标准偏差 (RSD%) 分别在 0.04-0.06%和1.5-2.8%之间，方法精密度良好。 表4 1 ng/mL马兜铃酸标准溶液连续6针重复性结果 化合物 RSD%(1ng/L) R.T. Area 马兜铃酸A 0.05 1.5 马兜铃酸B 0.06 2.8 马兜铃酸C 0.04 2.7 马兜铃内酰胺 0.04 1.9 2.4加标回收率及重复性考察 按照1.4前处理方法，对辛芩颗粒制剂样品进行低、中、高三个浓度水平加标回收率考察。每个浓度平行制备三份样品，进行重复性考察。低、中、高三个加标浓度分别为 0.025 mg/kg、0.5 mg/kg 和 2.5 mg/kg。三水平加标回收率及重复性结果见表5。 表5 三浓度水平加标回收率及重复性计算结果((n=3) 名称 0.025mg/kg 0.5 mg/kg 2.5 mg/kg 回收率(9) RSD(%) 回收率(%) RSD(%) 回收率(%) RSD(%) 马兜铃酸A 97.9 1.5 95.1 2.2 94.4 3.5 马兜铃酸B 93.8 3.4 93.3 3.1 90.7 2.4 马兜铃酸C 98.0 2.7 94.7 1.9 93.1 3.5 马兜铃内酰胺 97.4 1.8 92.4 2.8 103.4 4.3 结论 本文利用岛津 LCMS-8050 三重四级杆液质联用仪定量测定了辛芩颗粒制剂中4种马兜铃酸。实验结果表明，在 0.05-100 ng/mL 浓度范围内，方法线性良好，线性判定系数在 0.9995-0.9999 之间。曲线各标点准确度在90.8-111.6%之间。1ng/mL标准溶液连续进样6次，保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD%)分别在0.04-0.06%和1.5-2.8%之间，方法精密度良好。0.025 mg/kg、0.5 mg/kg 和2.5 mg/kg 三个不同浓度加标回收率在90.7-103.4%之间，平行三份样品的相对标准偏差(RSD%)在1.5-4.3%之间。该方法灵敏，准确，稳定性好，回收率高，抗假阳性能力强，适用于辛芩颗粒制剂中4种马兜铃酸的检测。 岛津应用云 使用岛津三重四极杆液相色谱质谱联用仪（LCMS-8050）开发了辛芩颗粒制剂中4种马兜铃酸的检测方法。实验结果表明，在0.05-100   ng/mL浓度范围内，方法线性良好，线性相关系数在0.9995-0.9999之间。曲线各标点准确度在90.8-111.6%之间。1   ng/mL标准溶液连续进样6次，保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD%)分别在0.04-0.06%和1.5-2.8%之间，方法精密度良好。0.025   mg/kg、0.5 mg/kg和2.5 mg/kg三个不同浓度加标回收率在90.7-103.4%之间，平行三份样品的相对标准偏差(RSD%)在1.5-4.3%之间。该方法简单、方便、准确，适用于辛芩颗粒制剂中马兜铃酸的检测