饲料中9种α受体激动剂检测方案(液质联用仪)

SSL-CA20-381Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-514 LCMS-8045 分析饲料中9种a-受体激动剂 LCMSMS-516 摘要：本文使用岛津超高效液交色谱-三重四极杆质谱仪 LCMS-8045，建立了动物源性食品中可乐定等9种α-受体激动剂的测定方法。饲料样品经用乙腈提取， SHIMSEN Styra MCX 固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱测定，外标法定量。结果显示该方法线性良好，标准曲线相关系数均≥0.990， 50 ug/kg 加标回收率在67.4%~120.9%之间，相对标准偏差(RSD)<3.59%。该方法可用于饲料中α-受体激动剂的定量。 a-受体激动剂作为一种新型的具有促进生长及提高瘦肉率作用的药物逐步引起公众的关注，且在饲料行业中已有非法添加使用的趋势。早在2010年，农业部1519号公告已明确把可乐定、赛庚啶等列入了农业部《禁止在饲料和动物饮水中使用的物质》清单。-O《GB31650-2019食品中兽药最大残留限量》规定，仅赛拉嗪可用于非产奶期的牛、马等动物，其他α-受体激动剂均禁止用于畜禽养殖，且不得检出。农业农村部 197-5-2019号公告《饲料中可乐定等7种a-受体激动剂的测定液相色谱-串联质谱法》，规定了可乐定、赛拉嗪、美托米啶、胍那苄、利美尼定、胍法新、替扎尼定在饲料中的含量测定方法。 本文在197-5-2019公告基础上，增加了溴莫尼定、安普乐定两种a-受体激动剂，使用 LCMS-8045 的建立了饲料中9种a-受体激动剂的测定方法。该方法快速、稳定，适合饲料相关行业。 实验部分 1.1仪器 岛津超高效液相色谱与三重四极杆质谱仪联用系统 LCMS-8045。具体配置如下 输液泵：LC-20ADXR×2系统控制器：CBM-20A自动进样器：SIL-30ACMP三重四极杆质谱仪：LCMS-8045柱温箱：CTO-20AC色谱工作站：LabSolutions Ver. 5.97 1.2分析条件 液相色谱条件： 色谱柱： Shim-pack GIST (100 mm×2.1 mm l.D.， 2.0 um)岛津(上海)实验器材有限公司，P/N： 227-30001-04 流动相：流动相 A-0.2%甲酸水溶液流动相B-乙腈 流速：0.3mL/min 柱温：40℃ 进样量：5uL 洗针模式： RO+R3， RO 为甲醇/水=1：1， R3为甲醇/乙腈/异丙醇/水=1：1：1：1(含 0.1%TFA)洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为20%，时间程序见表1。 表1 梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 3.00 Pumps Pump B Conc. 30 4.00 Pumps Pump B Conc. 30 4.50 Pumps Pump B Conc. 80 5.50 Pumps Pump B Conc. 80 5.60 Pumps Pump B Conc. 10 8.00 Controller Stop 质谱条件： 分析仪器： LCMS-8045加热模块温度：300℃离子源： ESI*(1.5 kV)DL 温度：150℃雾化气流速： 3.0L/min离子源温度：400℃加热气流速：10.0L/min扫描模式：多反应监测(MRM)干燥气流速： 10.0 L/min MRM参数：见表2 表2 MRM 参数 序号 化合物名称 英文名 前体离子 产物离子 CE 1 可乐定 Clonidine 230.20 213.00* -25 230.20 160.00 -36 221.20 90.00* -23 2 赛拉嗪 Xylazine 221.20 147.10 -24 221.20 164.00 -26 3 美托米啶 Dexmedetomidine 201.30 68.00* -35 201.30 95.10 -19 231.20 85.10 -16 4 胍那苄 Guanabenz 231.20 171.90* -23 231.20 136.00 -32 5 利美尼定 Limenedine 181.30 67.10* -22 181.30 95.10 -14 246.20 159.00 -30 6 胍法新 Guanfacine 246.20 60.10* -17 246.20 122.90 -47 7 替扎尼定 Tizanidine 254.20 44.10* -27 254.20 209.80 -29 8 溴莫尼定 Brimonidine 292.20 212.10* -29 292.20 170.10 -42 9 安普乐定 Apraclonidine 245.20 174.10* -27 245.20 208.50 -25 1.3标准品及试剂 标准品：盐酸替扎尼定 (Tizanidine hydrochloride，C，HgCIN，S·HCI，CAS：64461-82-1)、溴莫尼定(Brimonidine，CnH1oBrNs， CAS：59803-98-4)、盐酸安普乐定 (Apraclonidine hydrochloride，C，H1oN4CI·HCI，CAS：73218-79-8)、盐酸可乐定 (Clonidine hydrochloride，C，H1oCl3N3， CAS：4205-91-8)，含量均≥98%，购自中检院；盐酸赛拉嗪 (Xylazine Hydrochloride，C12H16N2S， CAS：7361-61-7)，含量≥98%，购自TRC公司；盐酸右美托米啶 (Dexmedetomidine hydrochloride， C13H17CIN2， CAS：145108-58-3)，，购自南京泽和医药科技有限公司；盐酸胍法新 (Guanfacine hydrochloride， C，H10ClN3O， CAS： 29110-48-3)，含量≥99.52%，购自CFW LABORATORIES公司；胍那苄 (Guanabenz ， CgHgClN4， CAS：5051-62-7)，购自上海陶素生化科技有限公司；磷酸利美尼定 (Rilmenidine phosphate， C1oH19N20sP， CAS： 85409-38-7)含量≥97%，购自凯立德生物医药技术有限公司。 试剂： SHIMSEN Styra MCX(SGLC 货号，380-00853-01)固相萃取柱，室温保存。 乙腈：色谱级，室温保存。 超纯水：蒸馏水由 Milli-Q Plus 水净化系统经去离子与二次净化制得。 甲酸：色谱级，纯度98%，室温保存。 1.4样品及标准曲线配制 1.4.1样品制备 参考农业农村部197-5-2019号公告《饲料中可乐定等7种a-受体激动剂的测定液相色谱-串联质谱法》前处理方法：取试料2g(准确至±1mg)，于50mL离心管中，加20mL 甲醇/0.2%甲酸水(9：1，v/v) 提取液，涡旋混匀，振荡20 min， 于8000 r/min 离心10 min，取上清液。 SHIMSEN Styra MCX(岛津(上海)实验器材有限公司 P/N： 380-00853-01) 固相萃取柱依次用甲醇、水各3mL活化。取备用液2mL过柱，用水3mL、甲醇3mL分别淋洗，抽干，5%氨水甲醇溶液5mL洗脱，收集洗脱液，50℃氮吹至干，1.0 mL 流动相初始溶液复溶，过 0.22 um 尼龙滤膜，上机。 1.4.2标准曲线制备 分别精密量取混合标准工作液适量，用初始比例流动相稀释配制成浓度为0.5、1、2、10、和50 ug/L 系列混合标准工作液，临用现配。 结果讨论 2.1标品质谱图与色谱图 将100 ug/L 混标溶液进样分析，采用产物离子扫描模式确认可乐定等9种a-受体激动剂的碎片离子，如下图1所示，产物离子清晰可辨。对空白溶剂和 0.5 ug/L 混标溶液分析， MRM 色谱图如图2所示，空白溶剂无干扰，且9种a-受体激动剂在 4 min 内实现了良好分离。 图19种α-受体激动剂MS质谱图 图2 0.5 ug/L 混标色谱图 2.2性性关系及检出限、定量限 对系列混合标准曲线溶液进行分析，以面积为纵坐标，浓度为横坐标，进行线性拟合。结果如表3和图3所示，可乐定等5种目标物在 0.5-50 ug/L范围内，线性良好，线性相关系数均≥0.990。以0.5 ug/L 数据为依据，根据信噪比 S/N=3、S/N=10计算检出限(LOD)、定量限(LOQ)，检出限和定量限均低于1.45 ug/kg，满足测定需求。 Area 1.3e6可乐定 一 1.0e6· 7.5e5· 5.0e5 2.5e5 0.0e0-二 Area 8.0e6--胍那苄 6.0e6- 一 4.0e6- 2.0e6 0.0e0 Area 8.0e6 6.0e6· 4.0e6 2.0e6· 0.0e0- 0 替扎尼定 图3标准曲线 R=0.9994256 40 Conc.(ng/mL) R=0.9984385 40 Conc. (ng/mL) R=0.9955810 40 Conc.(ng/mL) 序号 中文名称 线性方程 相关系数r 准确度(%) 检出限(ug/kg) 定量限(ug/kg) 1 可乐定 Y=(27095.3)X+(1888.07) 0.999 92.89-106.8 0.5 1.45 2 赛拉嗪 Y=(238226)X+(9309.90) 0.999 93.04-105.22 0.05 0.1 3 美托米啶 Y=(186014)X+(11710.1) 0.999 95.48-103.63 0.2 0.55 4 胍那苄 Y=(167677)X+(16724.9) 0.999 92.6-105.18 0.2 0.6 5 利美尼定 Y=(430629)X+(30336.0) 1.000 95.95-103.97 0.1 0.35 6 胍法新 Y=(312957)X+(33857.0) 0.998 91.36-106.47 0.02 0.05 7 替扎尼定 Y=(227785)X+(33925.6) 0.994 83.21-109.91 0.1 0.25 8 溴莫尼定 Y=(106630)X+(6515.39) 0.999 95.74-105.04 0.005 0.02 9 安普乐定 Y=(125496)X+(14519.1) 0.996 85.73-107.04 0.1 0.3 2.3重复性考察 对1 ug/L的标准溶液连续分析6次，计算保留时间和峰面积的RSD。结果见表4，保留时间 RSD<0.6%，峰面积的 RSD<3.59%。仪器稳定性良好。 表4 保留时间和面积RSD 序号 中文名称 保留时间 RSD(%) 面积 RSD (%) 1 可乐定 0.55 3.58 2 赛拉嗪 0.37 3.13 3 美托米啶 0.40 2.75 4 胍那苄 0.48 2.34 5 利美尼定 0.49 1.40 6 胍法新 0.46 2.26 7 替扎尼定 0.45 1.21 8 溴莫尼定 0.45 1.99 9 安普乐定 0.38 2.28 2.4加标回收率考察 在空白饲料样品上进行 50 ug/kg 的加标回收试验，平行3份。结果见表5，可乐定等5种目标物平均回收率在67.4%~120.9%之间， RSD 均<3.5%。满足测定需要。 表5饲料加标回收率结果 序号 中文名称 加标浓度(50ug/kg) 加标回收率/% 重复性/% 可乐定 112.0 3.46 2 赛拉嗪 105.2 1.93 3 美托米啶 120.9 0.64 4 胍那苄 109.4 1.86 5 利美尼定 72.1 1.23 6 胍法新 108.2 0.30 7 替扎尼定 94.4 1.35 8 溴莫尼定 67.4 0.70 9 安普乐定 97.4 2.12 结论 本文使用岛津超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪 LCMS-8045，建立了饲料中9种a-受体激动剂测定方法。方法定量限均低于1.45pg/kg，线性良好，线性相关系数均≥0.990，50 ug/kg加标回收率在67.4%~120.9%之间。该方法灵敏度高、准确，可供相关行业参考。 岛津应用云 *定量离子对 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.-Analytical Applications CenterTel：mail： sshzyan@shimadzu.com.cnhttp：//www.shimadzu.com.cn 本文使用岛津超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪LCMS-8045，建立了动物源性食品中可乐定等9种α-受体激动剂的测定方法。饲料样品经用乙腈提取，SHIMSEN   Styra MCX固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱测定，外标法定量。结果显示该方法线性良好，标准曲线相关系数均≥0.990，50   μg/kg加标回收率在67.4%～120.9%之间，相对标准偏差(RSD)<3.59%。该方法可用于饲料中α-受体激动剂的定量。