饲料中硫酸新霉素检测方案(液相色谱仪)

SSL-CA20-657Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-580 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.-Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cnTel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn LC-MS/MS 测定饲料硫硫酸新霉素 LCMSMS-580 摘要：本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪测定饲料中硫酸新霉素的方法，该方法可在10 min 内完成对目标物的检测。硫酸新霉素在100.0 ng/mL~5000.0 ng/mL 浓度范围内线性良好，校准曲线线性相关系数r在0.999以上，且精密度和回收率实验结果均符合标准要求。该方法灵敏度高，分析时间短，结果准确， 可用于饲料中硫酸新霉素的快速检测。 关键词：三重四极杆质谱饲料硫酸新霉素 硫酸新霉素为氨基糖苷类广谱抗菌素，是由链霉菌经培养发酵产生，具有抗菌谱广、抗菌能力强和吸收排泄良好等特点，水溶性好以及化学性质稳定，在临床、畜牧以及农业方面应用广泛。但是硫酸新霉素对人体有着显著的肾毒性和耳毒性副作用。滥用兽药极易造成动物源食品中有害物质的残留，这不仅会对人体健康造成直接危害，而且对畜牧业的发展和生态环境也会造成极大破坏。农业部公告第168号《饲料 药物添加剂使用规范》附录2中明确规定，所有商品饲料中不得添加硫酸新霉素。 本文参照农业农村部公告第197号-3-2019)(《饲料中硫酸新霉素的测定液相色谱-串联质谱法》，建立了使用岛津超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用测定饲料中硫酸新霉素的方法。该方法灵敏度高，分析时间短，结果准确，可用于饲料中硫酸新霉素的快速检测。 实验部分 1.1仪器 本实验使用超高效液相色谱仪 LC-40 X3与三重四极杆质谱仪 LCMS-8045 联用系统。 具体配置为： 系统控制器：CBM-40自动进样器： SIL-40CX3输液泵： LC-40BX3×2质谱仪： LCMS-8045柱温箱： CTO-40S色谱工作站： LabSolutions Ver. 5.99 SP2 1.2分析条件 液相条件 色谱柱： InertSustain-AQ C18 (100mm×2.1mm l.D.，1.9 um， SGLC，Cat.No.： 5020-89939) 流动相：A相-七氟丁酸溶液(2.6mL/L)；B相-乙腈，时间程序见表1。 流速：0.30 mL/min 柱温：40℃ 进样体积：1.0pL 洗脱方式：梯度洗脱，初始浓度为B相10% 表1 梯度洗脱程序 Time Module Command Value 6.00 Pumps Pump B Conc. 80 6.10 Pumps Pump B Conc. 10 10.00 Controller Stop 质谱条件 离子源：ESI，正离子模式 DL管温度：250℃ 离子源接口电压：4.0kV 加热模块温度：400℃ 雾化气氮气 3.0 L/min 接口温度：300℃ 干燥气：氮气10 L/min 扫描模式：多反应监测(MRM) 加热气：空气10 L/min MRM 参数：见表2 碰撞气：氩气(230kPa) 驻留时间： 97 msec 表2 MRM 参数 化合物名称 监测离子对 Q1 pre (V) CE Q3 Pre (V) 硫酸新霉素 615.40>161.15* -20.0 -29.0 -30.0 615.40>163.10 -20.0 -33.0 -30.0 615.40>293.25 -20.0 -23.0 -22.0 注：*表示定量离子对 1.3标准溶液的配制 准确称取 10 mg硫酸新霉素标准品，用水配制1.0 mg/mL标准物质溶液，置于冰箱中冷藏保存，有效期3个月。 1.4样品前处理方法 (1)提取：准确称取饲料试样2g于50mL离心管中，准确加入20 mL 磷酸盐缓冲溶液(含0.15 g/LEDTA 和20 g/L三氯乙酸溶液)，振荡提取20 min， 以 8000 r/min 离心 5 min， 准确吸取上清液5mL， 加入七氟丁酸溶液(13mL/L) 1mL， 混匀，作为备用液。 (2)净化：固相萃取柱(C18，500 mg/3mL)依次用3mL甲醇、3mL水、3mL七氟丁酸溶液(2.6mL/L)活化，备用液全部过柱，用3mL水淋洗，抽干，用4mL洗脱液洗脱，洗脱液40C氮吹至近干，用1mL七氟丁酸溶液(2.6mL/L)溶解，过 0.22 um 滤膜后，上机测定。 结果讨论 2.1标准样品的 MRM 色谱图 图11基基质标准曲线中 100 ng/mL标准品 MRM 色谱图 2.2线性范围与检出限 取空白饲料样品溶液六份，添加硫酸新霉素标准物质工作液，使其浓度分别为100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL、1000 ng/mL、5000 ng/mL， 作为添加样品，与检材样品平行操作。以待测物特征离子峰面积为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，外标法绘制标准曲线，如图2所示。根据检出限MDL = 3.3 S/N，计算检出限，所得校准曲线线性关系良好，线性方程及相关系数见表3。 图22硫酸新霉素校准曲线 表3 标准曲线与检出限信息 化合物 R 线性范围(ng/mL) 检出限(mg/kg) 准确度，% 硫酸新霉素 0.9996 100.0~5000.0 0.05 90.18-126.33 2.3精密度 对浓度为200 ng/mL 的硫酸新霉素标准工作液连续测定6次，考察仪器的精密度，保留时间和峰面积的重复性结果如表4所示。结果显示：保留时间和峰面积的 RSD 分别为 0.06%和2.53%，仪器精密度良好。 表4 保留时间和峰面积重复性结果(n=6) # 保留时间 (min) 峰面积 4.094 17187 2 4.092 17639 3 4.086 16959 4 4.092 16454 5 4.090 16589 6 4.093 17123 RSD(%) 0.06 2.53 2.4回收率 称取空白饲料样品，加入硫酸新霉素标准溶液，使加标浓度为 1.0 mg/kg。按照1.4样品前处理方法提取净化后，测定硫酸新霉素的加标回收率。空白饲料样品和加标饲料样品 MRM色谱图如图3所示， 平行3次测试，平均加标回收率为92.25%， RSD=5.05%。 图3 空白饲料样品和加标浓度为 1.0 mg/kg 饲料样品 MRM 色谱图 结论 本文参照农业农村部公告第197号-3-2019《饲料中硫酸新霉素的测定液相色谱-串联质谱法》，建立了一种使用岛津超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用测定饲料中硫酸新霉素的方法，该方法可在 10 min 内完成对目标物的检测。硫酸新霉素在100.0 ng/mL~5000.0 ng/mL 浓度范围内线性良好，校准曲线线性相关系数r在0.999以上，保留时间和峰面积的 RSD 分别为 0.06%和2.53%，仪器精密度良好。该方法灵敏度高，分析时间短，结果准确，可用于饲料中硫酸新霉素的快速检测。 岛津应用云 本文参照农业农村部公告第197号-3-2019《饲料中硫酸新霉素的测定 液相色谱-串联质谱法》，建立了一种使用岛津超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用测定饲料中硫酸新霉素的方法，该方法可在10 min内完成对目标物的检测。硫酸新霉素在100.0 ng/mL~5000.0 ng/mL浓度范围内线性良好，校准曲线线性相关系数r在0.999以上，保留时间和峰面积的RSD分别为0.06%和2.53%，仪器精密度良好。该方法灵敏度高，分析时间短，结果准确，可用于饲料中硫酸新霉素的快速检测。