饲料中37种霉菌毒素检测方案(液质联用仪)

SSL-CA20-604Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-566 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD. - Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cnTel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn LCMSMS 测定饲料中37种霉菌毒素的含量 LCMSMS-566 摘要：本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用测定饲料中37种霉菌毒素的方法。37种霉菌毒素共分为A、B和C三组，分别在0.5~50 ng/mL、5~500 ng/mL 和10~1000 ng/mL 的浓度范围内线性良好，相关系数r在0.998以上。在高、中、低三个基质标样浓度下，保留时间和峰面积的RSD%分别在0.01%~0.86%和0.69%~14.97%之间，仪器精密度良好。即便在标准要求的检测限加标浓度下，83%以上的化合物回收率在70%~130%之间。该方法灵敏度高，分析时间短，结果准确，适用于饲料中多种霉菌毒素的测定。 关键词：三重四极杆质谱饲料霉菌毒素 饲料及农产品中霉菌毒素污染是一个全球性问题，即使微量摄入也可导致严重的动物神经和组织危害，最终给人类的农业生产和食品安全带来严重挑战。霉菌毒素由于种类多、结构差异大以及样品基质复杂等原因，其检测标准多为单一或单类霉菌毒素检测，多类毒素高通量测定一直是检测瓶颈。中华人民共和国农业农村部公告第357号发布，2021年4月1日，农业行业标准NY/T3803-2020《饲料中37种霉菌毒素的测定液相色谱串联质谱法》实施，适用于配合饲料、 浓缩饲料、精料补充料和植物性饲料原料中霉菌毒素的检测，这是国内首个饲料中霉菌毒素高通量标准，将扩大我国饲料及畜产品中霉菌毒素监测范围，提升风险发现能力。 本文参考 NY/T3803-2020，使用岛津超高效液相色谱串联质谱仪，建立了37种霉菌毒素的测定方法。本方法简便、快速、准确、灵敏度高，结果准确，供相关人员参考。 1.1仪器 本实验采用岛津 Nexera LC-40 X3 与三重四极杆质谱仪 LCMS-8050联用系统。具体配置为： 系统控制器：SCL-40 自动进样器： SIL-40C X3 输液泵：LC-40DX3×2 质谱仪：LCMS-8050 柱温箱：CTO-40C 色谱工作站： LabSolutions Ver. 5.99 在线脱气机： DGU-405 1.2分析条件 液相条件 色谱柱： Shim-pack Velox SP-C18 (100 mm x2.1 mml.D.，1.8 um， 岛津(上海)实验器材有限公司， P/N：227-32001-03) 流动相：A相-0.1%甲酸 +0.1 mmol/L 乙酸铵水溶液，B相-0.1%甲酸+90%甲醇水溶液 流速：0.30mL/min 柱温：40℃ 进样体积：0.5uL 洗脱方式：梯度洗脱，初始浓度为B相5%，时间程序见表1。 表1 梯度洗脱程序 Time Module Command Value 2.00 Pumps Pump B Conc. 5 4.00 Pumps Pump B Conc. 20 12.00 Pumps Pump B Conc. 95 12.10 Pumps Pump B Conc. 99 13.00 Pumps Pump B Conc. 99 13.50 Pumps Pump B Conc. 5 16.00 Controller Stop 质谱条件 离子源：ESI，正离子模式DL管温度：250℃离子源接口电压：+0.5kV(Posi)，-2.5kV(Neg)加热模块温度：400℃雾化气：氮气3.0 L/min接口温度：300℃干燥气：氮气10 L/min扫描模式：多反应监测 (MRM)加热气：空气10 L/minMRM参数：见表2 碰撞气：氩气(270kPa) 样品前处理方法和标准溶液配制 2.1样品前处理 提取：称取5g(精确至0.01 g)试样于50mL离心管中，准确加入20mL提取液(乙腈：水：甲酸=840：159： 1，v/v/v)，涡旋混匀，振荡提取20 min， 于8 000 r/min 离心5 min，立即移取上清液，备用。 净化：将微孔滤膜连接到多重基质吸附型固相萃取柱的出口端，准确移取1mL上清液加载到上述萃取柱上，过柱速度保持在约1滴/s，收集全部滤液于进样小瓶中，待测。 表2 MRM 参数 组号 No. 中文名称 英文名称 化学式 CAS No. 前体 离子 产物 离子 Q1 Pre Bais(V) CE(V) Q3 Pre Bais(V) 1 黄曲霉毒素 G2 Aflatoxins G2 C17H1407 7241-98-7 331.1 189.0 245.1 -10 -16 -44 -31 -13 -17 2 黄曲霉毒素 G1 Aflatoxins G1 C17H1207 1165-39-5 329.1 243.1 200.0 -10 -16 -28 -41 -12 -21 A组 3 黄曲霉毒素B2 Aflatoxins B2 C17H1406 7220-81-7 315.1 287.0 259.0 -16 -12 -26 -31 -14 -19 4 黄曲霉毒素 B1 Aflatoxins B1 C17H1206 1162-65-8 313.0 285.2 241.0 -12 -16 -23 -37 -14 -16 5 杂色曲霉素 Sterigmatocystin C18H1206 10048-13-2 325.0 309.9 281.0 -16 -24 -26 -37 -15 -20 B组 6 赭曲霉毒素A Ochratoxin A C20H18CINO6 303-47-9 404.1 239.0 -15 -24 -16 221.0 -14 -37 -25 7 赭曲霉毒素B Ochratoxin B C20H19NO6 4825-86-9 370.1 205.0 -13 -22 -14 103.0 -27 -55 -20 组号No. 中文名称 英文名称 化学式 CAS No. 前体 离子 产物 离子 Q1 Pre Bais(V) CE(V) Q3 Pre Bais(V) 8 T-2三醇 T-2 Trio C20H3007 97373-21-2 405.1 303.0 124.9 -12 -14 -18 -19 -11 -23 9 T-2毒素 T-2 toxin C24H340 21259-20-1 484.1 185.0 305.0 -17 -11 -22 -15 -13 -11 10 HT-2毒素 HT-2 toxin C22H320： 26934-87-2 442.1 263.0 245.0 -10 -15 -15 -13 -13 -12 11 麦角醇 Lysergol C16H18NzO 602-85-7 255.1 197.0 44.0 -18 -13 -28 -15 -13 -16 12 麦角柯宁碱 Ergocornine C31H39N50s 564-36-3 562.3 208.1 223.1 -20 -20 -46 -35 -14 -15 B组 13 β-玉米赤霉醇 B-zearalanol C18H2605 42422-68-4 321.1 277.2 303.1 12 10 23 23 19 14 14 β-玉米赤霉烯醇 B-Zearalenol C18H2405 71030-11-0 319.1 275.1 16 20 24 301.1 16 21 13 15 a-玉米赤霉醇 a-zearalanol C18H2605 26538-44-3 321.1 277.2 12 23 19 303.1 10 23 14 16 玉米赤霉酮 Zearalenone C18H2405 5975-78-0 319.1 275.1 301.1 12 15 22 21 19 14 17 a-玉米赤霉烯醇 a-Zearalenol C18H2405 36455-72-8 319.1 275.1 12 22 30 301.1 12 21 14 18 玉米赤霉烯酮 Zearalenone C18H2205 17924-92-4 317.1 131.1 175.1 16 12 31 25 27 11 19 展青霉素 Patulin C-H，04 149-29-1 155.0 71.1 81.0 -13 -12 -12 -15 -27 -17 20 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 Deoxynivalenol C15H2006 51481-10-8 297.1 249.0 203.0 -20 -17 -13 -17 -18 -15 21 青霉酸 Penicillic Acid lCgH1004 90-65-3 171.0 97.0 82.0 -11 -13 -17 -25 -19 -15 22 C 组 23 镰刀菌烯醇-X Fusarenon X C17H220： 23255-69-8 355.0 246.9 175.1 -13 -10 -14 -21 -18 -20 新茄病镰刀菌烯醇 Neosolaniol C19H260： 36519-25-2 400.1 185.0 215.0 -14 -14 -20 -20 -13 -24 24 15-乙酰基脱氧雪腐 镰刀菌烯醇 15-Acetyl- deoxynivalenol C17H2207 88337-96-6 339.0 137.0 321.0 -12 -12 -12 -10 -14 组号卜N0. 中文名称 英文名称 化学式 CAS NO. 前体 离子 产物 离子 Q1 Pre Bais(V) CE(V) Q3 Pre Bais(V) 27 蛇形毒素 Diacetoxyscirpenol C19H2607 2270-40-8 384.1 307.1 105.0 -26 -14 -13 -39 -22 -21 28 渥曼青霉素 Wortmannin C23H240g 19545-26-7 428.9 354.9 313.0 -23 -20 -10 -15 -25 -16 29 娄地青霉素C RoquetortineC C22H23N502 2 58735-64-1 390.1 193.1 108.1 -14 -14 -22 -44 -13 -21 30 伏马毒素 Bl Fumonisin B1 C34H59NO15 116355-83-0 722.3 352.2 334.2 -20 -20 -38 -40 -13 -17 31 腾毒素 Tentoxin C22H30N404 28540-82-1 415.2 312.1 -26 -22 -22 256.2 -15 -31 -18 C组 32 霉酚酸 Mycophenolic acid C17H2006 24280-93-1 321.0 207.0 159.0 -12 -16 -18 -35 -14 -11 33 伏马毒素B3 Fumonisin B3 C34H59NO141422359-85-0 0706.3 336.2 354.2 -20 -20 -36 -34 -17 -13 34 伏马毒素B2 Fumonisin B2 C34H59NO14116355-84-1 1706.3 336.2 354.2 -20 -20 -37 -35 -17 -13 35 黄绿青霉素 Citreoviridin C23H3006 25425-12-1 403.0 297.0 285.1 -16 -16 -14 -14 36 疣孢青霉原 Verruculogen C27H33N301 12771-72-1 534.1 392.2 -26 -14 -14 435.1 -34 -16 -22 37 青霉震颤素A Penitrem A C37H44CINO。12627-35-9 634.1 558.1 -22 -21 -20 616.1 -36 -14 -24 2.2标准溶液的配制 各组的混合标准储备溶液(100 ug/mL)：按照MRM参数表的分组称取适量的标准品，置于10 mL容量瓶中，A组和B组用乙腈，C组用乙腈-甲醇溶液 (50：50， v/v) 溶解、定容，分别配制成浓度为 100 ug/mL的混合标准储备溶液。 各组的混合标准中间溶液(4 ug/mL)：分别准确移取400 uL各组的混合标准储备溶液置于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，混匀。 全混合标准系列工作溶液：分别准确移取适量的各组的混合标准中间溶液，用乙乙配制成全混合标准系列溶液，其中A组待测物浓度分别为0.5、2、5、10、20和50 ng/mL；B组待测物浓度为5、20、50、100、200 和500 ng/mL； C组为10、40、100、200、400和1000 ng/mL. 结果与讨论 3.1标准样品的 MRM 色谱图 图1 37种霉菌毒素基质标样 MRM 色谱图 (A、B和C组浓度分别是0.5、5和10 ng/mL) 3.2线性范围与检测限 取空白样品，按2.1提取方法得到空白基质提取溶液。准确移取1mL全混合标准系列工作溶液，，于60℃真空浓缩或氮吹至近干，加入1mL空白样品提取溶液，涡旋混匀。再按2.1净化方法，得到基质匹配混合标准系列溶液，外标法制作标准曲线。37种化合物线性相关性系数均大于0.998。以下是部分化合物的标准曲线图。 图2 部分化合物校准曲线 表3 37 种霉菌毒素标准曲线及检测限、定量限、准确度 编号 化合物 标准曲线 相关性系数R 检测限(ng/mL) 定量限(ng/mL) 展青霉素 Y=(254.333)X+(3431.18) 0.9991 3.68 11.14 2 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 Y=(1507.93)X+(16350.7) 0.9998 0.28 0.85 3 麦角醇 Y=(36688.1)X+(629834) 0.9984 0.04 0.14 4 青霉酸 Y=(5989.72)X+(-2815.96) 0.9998 0.69 2.09 5 镰刀菌烯醇-X Y=(349.734)X+(376.869) 0.9998 2.89 8.75 6 新茄病镰刀菌烯醇 Y=(8857.76)X+(-137321) 0.9990 0.49 1.50 3.3精密度实验 浓度为0.5、5和50 ug/L (以组A成分浓度计)的基质标准工作液连续测定6次，考察仪器的精密度。不同浓度样品中待测物保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在 0.01%~0.86% 和0.69%~14.97%之间，仪器精密度良好。 表4 基质中各化合物分析重复性结果 3.4回收率实验 取空白样品，加入混合标准溶液，使得加标浓度分别为2和20 ug/kg(以组A成分浓度计)按2.1提取和净化方法后，测定待测物的加标回收率。在这两个加标浓度下，加标回收率结果见图3，可见即便在标准要求的检测限加标浓度下，83%以上的化合物回收率在70%~130%之间。 m!回收率70%-130%m[回收率 50%-70%m回收率 30%-50% ■回收率70%-130%mm回收率50%-70%m回收率30%-50% 结论 本文根据 NY/T3803-2020《饲料中37种霉菌毒素的测定液相色谱串联质谱法》，建立了使用岛津超高效液相色谱 LC-40 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 联用测定饲料中37种霉菌毒素的检测方法。该方法可在16 min 内完成对待测物的检测，37种霉菌毒素分为三组，分别在0.5~50 ng/mL、5~500 ng/mL 和10~1000ng/mL的浓度范围内线性良好，相关系数r在0.998 以上。且精密度和回收率实验结果良好。该方法灵敏度高，分析时间短，结果准确，可用于饲料中多种霉菌毒素的定量检测。 岛津应用云 本文参考NY/T3803-2020，使用岛津超高效液相色谱串联质谱仪，建立了37种霉菌毒素的测定方法。该方法可在16 min内完成对待测物的检测，37种霉菌毒素分为三组，分别在0.5~50 ng/mL、5~500 ng/mL和10~1000 ng/mL的浓度范围内线性良好，相关系数r在0.998以上。且精密度和回收率实验结果良好。该方法灵敏度高，分析时间短，结果准确，可用于饲料中多种霉菌毒素的定量检测。