畜禽尿液中兽药检测方案(液质联用仪)

SSL-CA20-380Excellence in Science Excellence in ScienceLCMS-QTOF-030 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.- Analytical Applications CenterTel：86(21)34193996Email： sshzyan@shimadzu.com.cnhttp：//www.shimadzu.com.cn 岛津高分辨液质联用仪 LCMS-9030 筛查尿液中150种兽药 LCMS-QTOF-030 摘要：本文利用岛津 LCMS-9030 超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱仪，建立了尿液中150种兽药的鉴别和确认方法。LabSolutions insight 建立了150种兽药的高分辨二级质谱库，根据保留时间及精确质量数进行鉴别，二级质谱库及典型二级碎片离子丰度比进行确认。100 ng/mL 浓度的加标样品，其中113个化合物的回收率在50-120%之间。本方法适用于畜禽尿液中多兽药残留的筛查。 关键词： LCMS-9030 四极杆飞行时间质谱 尿液 兽药 农业农村部2019年8月，发布了第197号-9-2019公告《畜禽血液和尿液中150种兽药及其它化合物鉴别和确认液相色谱-高分辨串联质谱法》，规定了猪血、牛血、羊血和鸡血以及猪尿、牛尿、羊尿中150种兽药及其他化合物的液相色谱-高分辨串联质谱鉴别和确认方法。150种兽药包括磺胺类、喹诺酮类、咪唑与苯并咪唑类、苯并咪唑类、聚醚类、大环内酯类、甾体类、β受体激素、精神类、兴奋剂、中枢神经类、 抗组胺类、抗真菌类、非甾体类等。标准于2020年1月1日起正式实施，是首个动物养殖中检测跨类多残留的国家标准，极大的提高了对非标注成分的监测能力和效率。 本文参考农业农村部197-9-2019号标准，利用岛津LCMS-9030超高效液色色谱四极杆飞行时间质谱仪，建立了一种150种兽药的鉴别与确认方法。本方法简便、快速、准确、灵敏度高，供相关检测人员参考。 实验部分 1.1仪器 岛津LCMS-9030 超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱联用仪，具体配置为 输液泵：LC-30AD×2系统控制器：CBM-20Alite自动进样器：SIL-20AC飞行时间质谱仪：LCMS-9030柱温箱：CTO-20AC色谱工作站：LabSolutions Ver. 5.98 LabSolutions 在线脱气机：DGU-20A5R Insight Ver. 3.7 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱： Shim-pack GIST-HP C18-AQ 150 mm l.D.× 2.1 mm l.D..， 1.9 um(岛津(上海)实验器材有限公司， P/N： 227-30807-03) 流动相：A相-0.2%甲酸水+2mM乙酸铵；B相-0.2%甲酸甲醇 洗针模式：进样前后洗针， External only (进样针外壁清洗)， Rinse Port 流速： 0.25mL/min柱温：40℃进样体积： 2uL洗针液：甲醇/水=1：1(v：v) 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为5%，，E时间程序见表1。 表1 梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 0.50 泵 B.Conc 5 3.00 泵 B.Conc 15 10.00 泵 B.Conc 40 18.00 泵 B.Conc 100 23.00 泵 B.Conc 100 23.10 泵 B.Conc 26.00 控制器 Stop 质谱条件 离子源： ESI 加热模块温度：400℃ 雾化气流速：3.0 L/min DL 温度：250℃ 加热气流速：10.0L/min 接口温度：300℃ 干燥气流速：10.0 L/min 扫描模式： MS Scan(m/z50-1300)& DDA MS/MS (m/z 50-1000) 校准方法：外标法(Nal)，分辨率>30000(m/z1972)，质量误差<2 ppm 1.3试剂 甲醇：色谱级，室温保存。 实验用水：由 Milli-Q Plus 水净化系统经去离子与二次净化制得。 甲酸：色谱级，纯度98%，室温保存。 乙酸铵：色谱级，纯度99%，室温保存。 EDTA-Mcllvaine缓冲液：分别称取无水磷酸氢二钠 10.9 g， 乙二胺四乙酸钠 (EDTA-Na2)3 g，柠檬酸 12.9 g，加水溶解并定容至1000 mL。 1.4样品前处理 参考农业农村部197-9-2019公告《畜禽血液和尿液中150种兽药及其他化合物鉴别和确认液相色谱-高分辨串联质谱法》，取2mL尿液至50mL离心管中，加入3mL EDTA-Mcllvaine 缓冲液，涡旋混匀，再加入10.0 mL乙腈，涡旋 1 min 后加入4g硫酸钠、1g氯化钠，静置10 min 盐析分层，9500 r/min 条件下离心10.0mL，准确量取8mL 上清液于15mL离心管，40℃下氮吹至2mL，上机测定。 结果与讨论 2.1准确质量数提取结果 150种兽药提取离子流色谱图(EIC)如图1所示。 图1 150种兽药提取离子流色谱图 EIC图(100 ng/mL) 2.2方法检出限 配制浓度 100 ng/mL 的150种兽药混合标准样品，上机进行测定，150种兽药的方法检出限 (ASTM， S/N=3)为0.03~39.5mg/L， 满足法规要求。150种兽药品种信息、中英文名、CAS、一级精确质荷比、典型二级碎片离子、保留时间、检出限等结果见表2。 表2 150种兽药检出限 药 物编 理论精确 典型二级 典型二级 典型二级 保留召仪器检法规检时间 出限出限 分号组 中文名称 英文名称 分子式 CAS 号 质量数 碎片离子 1 碎片离子 2 碎片离子 3 (RT) min (LOD) (LOD) ng/mL ng/mL 1 苯甲酰磺胺 Sulfabenzamide C13H12N20；S 127-71-9 277.0641 156.0114 108.0444 92.0495 16.0 3.4 10 2 磺胺嘧啶 Sulfadiazine C10H10N40zS 68-35-9 251.0597 156.0114 108.0444 185.0822 13.6 0.1 50 3 磺胺间二甲 氧嘧啶 Sulfadimethoxine C12H14N404S 122-11-2 311.0809 156.0114 108.0431 92.0495 16.5 0.3 10 4 磺胺二甲基 嘧啶 Sulfamethazine C2H14NOS 57-68-1 279.091 186.0332 156.0114 92.0495 15.0 0.7 50 5 磺胺邻二甲 氧嘧啶 Sulfadoxine C12H14N404S 2447-57-6 311.0809 156.0114 108.0431 92.0495 15.8 0.4 50 6磺胺甲基嘧啶 Sulfamerazine C1H12N402S 127-79-7 265.0754 156.01 110.0713 199.0978 14.4 0.3 50 A 7磺胺甲噻二唑 Sulfamethizole CgH10N402S2 144-82-1 271.0318 156.0114 108.0431 92.0495 14.8 0.1 50 组8 磺胺甲氧 哒嗪 Sulfamethoxypyri- dazine C11H12N403S 80-35-3 281.0703 156.0114 108.0444 215.0927 15.0 0.2 50 9 磺胺苯吡唑 Sulfaphenazole C15H14NOS 526-08-9 315.091 160.0869 222.0332 108.0444 16.1 0.3 5 10 磺胺吡唑 Sulfapyrazole C16H16NOzS 852-19-7 329.1069 173.0947 156.0114 108.0444 16.5 0.3 10 11 磺胺吡啶 Sulfapyridine CH11N302S 144-83-2 250.0645 156.0114 184.0869 108.0444 14.0 0.2 50 12 磺胺喹恶啉 Sulfaquinoxaline C14H12N40S 59-40-5 301.0754 156.0114 108.0444 92.0495 16.7 1.5 50 13 磺胺噻唑 Sulfathiazole CgHN30S， 72-14-0 256.0209 156.0114 92.0495 65.0386 13.8 0.2 10 14 磺胺二甲异 嘧啶 Sulfisomidine C12H14NNaO，S 515-64-0 279.091 124.0869 186.0332 156.01 13.4 0.7 50 15甲氧苄氨嘧啶 Trimethoprim C14H18N403 738-70-5 291.1452 230.1162 123.0665 261.0982 14.4 0.2 50 1 西诺沙星 Cinoxacin C12H10N205 28657-80-9 263.0663 245.0557 217.0608 189.0295 16.6 0.5 5 2 达氟沙星 (单诺沙星) Danofloxacin C19H20FN3033 112398-08-0 358.1562 340.1456 314.1663 96.0808 14.9 0.6 10 3 双氟沙星 Difloxacin C21H19F2N303 98106-17-3 400.1467 382.1362 356.1569 299.0979 15.2 0.6 —— LCMS-QTOF-030 13 恶喹酸 (奥索利酸) Oxolinic acid C13H1NO5 14698-29-4 262.071 244.0604 160.0393 216.0291 16.9 0.2 5 14 沙拉沙星 Sarafloxacin C20H17F2N：03 98105-99-8 386.1311 368.1205 342.1412 299.0980 15.3 0.6 10 15 司帕沙星 Sparfloxacin C19H22FN403 110871-86-8 393.1733 375.1627 349.1834 292.1256 15.7 0.3 10 16 妥舒沙星 Tosufloxacin tosylate C26H23F3N4O，S 1400591-39- 0 405.1169 387.1063 314.0900 56.0495 16.0 0.1 50 1 阿苯达唑 (丙硫咪唑) Albendazole C12H15N30zS 54965-21-8 266.0958 234.0696 209.1159 99.0411 18.1 2.1 5 2 阿苯达唑-2- 氨基砜 Albendazole-2- aminosulfone C10H13N302S 80983-34-2 240.0801 198.0332 133.0635 72.0444 14.0 0.1 50 3 阿苯达唑 亚砜 Albendazole- sulfoxide C12H15N30；S 54029-12-8 282.0911 240.0437 159.0427 43.0532 16.2 17.2 50 4氨基甲苯咪唑 Mebendazoleamine C14H11N30 52329-60-9 238.0975 105.0335 77.0386 51.0229 16.2 0.3 5 5 噻苯哒唑 (噻苯咪唑) Thiabendazole C10H7N，S 148-79-8 202.0433 175.0324 131.0604 92.0495 15.1 0.2 5 6 二甲硝咪唑 (地美硝唑 Dimetridazole C5H7N302 551-92-8 142.0611 96.0682 81.0447 54.0338 13.3 0.1 50 C 7 芬苯达唑 (苯硫苯咪唑) Fenbendazole C15H13N30zS 43210-67-9 300.0801 268.0539 159.0427 190.0049 19.0 0.3 5 8 氟苯达唑 (氟苯咪唑) Flubendazole C16H12FN：0： 31430-15-6 314.0936 282.0673 123.0240 195.0292 18.2 0.4 10 9 羟基异丙 硝唑 Hydroxyipronida- zole C7H1N303 35175-14-5 186.0873 168.0768 122.0839 82.0526 15.6 0.3 50 10 异丙硝唑 Ipronidazole C-H1N302 14885-29-1 170.0924 124.0995 109.0760 96.0682 16.4 0.1 5 11 甲苯咪唑 Mebendazole C16H13N30： 31431-39-7 296.103 264.0768 105.0335 77.0386 18.1 0.1 10 12 噻苯咪唑酯 (坎苯达唑) Cambendazole C14H14N402S 26097-80-3 303.091 261.0441 217.0524 243.0335 16.9 0.4 5 1 5-羟基噻苯 咪唑 5-Hydroxythiaben- dazole C10H-N，OS 948-71-0 218.0383 191.0274 147.0553 81.0335 14.5 0.3 5 2 左旋咪唑 Levamisole C11H12NzS 14769-73-4 205.0794 178.0685 123.0263 91.0542 14.1 0.6 10 3 甲硝唑 (甲硝哒唑) Metronidazole C，H，N：0： 443-48-1 172.0717 128.0455 82.0526 45.0335 12.5 0.1 50 4 奥芬达唑 0xfendazole C15H13N30；S 53716-50-0 316.075 191.0689 284.0488 1590427 17.1 LCMS-QTOF-030 5 柱晶白霉素 Sineptina C40H67NO14 1392-21-8 786.4633 174.1125 109.0648 558.3273 17.9 1.0 50 6 螺旋霉素 Spiramycin C43H74N2014 8025-81-8 843.5213 174.1125 540.3167 699.4368 15.7 0.5 50 7 替米考星 Tilmicosin C46H80N，013 108050-54-0 869.5733 174.1125 696.4681 16.4 0.1 50 8 泰乐菌素 Tylosin C46H77NOi7 1401-69-0 916.5264 174.1125 772.4451 598.3559 17.4 0.1 50 9 维吉尼霉素 M1 Virginiamycin M1 C28H35N307 21411-53-0 526.2551 355.1289 508.2442 133.0648 18.3 0.1 5 1 倍氯米松 Beclomethasone C22H2gCIO5 4419-39-0 409.1778 391.1671 355.1904 279.1744 18.3 0.1 50 2 倍氯米松双 丙酸酯 Beclomethasone dipropionate C28H37CIO7 5534-09-8 521.2315 503.22 319.1693 411.2166 20.1 0.2 5 3 倍他米松双 丙酸酯 Betamethasone dipropionate C28H37FO， 5593-20-4 505.2596 411.2166 319.1693 279.1744 19.9 0.2 5 4 倍他米松戊 酸酯 Betamethasone valerate C27H37FO6 2152-44-5 477.2647 355.1904 279.2744 337.1798 19.7 0.1 50 5 醋酸氯地 孕酮 Chlormadinone acetate C23H29CIO4 302-22-7 405.1837 345.1616 309.1849 301.1354 19.7 0.2 5 6 氯倍他索丙 酸酯 Clobetasol- 17 propionate C25H32CIFO， 25122-46-7 467.1995 355.1471 373.1577 279.1755 19.5 0.0 10 7 氯倍他松丁 酸酯 Clobetasone C26H32CIFO， 25122-57-0 479.1995 343.1459 279.138 371.1408 19.9 0.2 10 butyrate 8 可的松 Cortisone C21H2805 53-06-5 361.201 163.1117 121.0648 343.1904 17.6 0.1 50 9 地夫可特 Deflazacort C25H31NO6 14484-47-0 442.2224 424.2119 382.2013 400.2119 18.8 0.1 5 10 地塞米松 Dexamethasone C22H29FO5 50-02-2 393.2072 355.1904 373.2010 337.1798 18.2 0.3 5 11 二氟拉松双 醋酸酯 Diflorasone Diacetate C26H32F201 33564-31-7 495.2189 317.1536 335.1642 395.1853 19.0 0.0 50 12 表睾酮 Epitestosterone C19H280， 481-30-1 289.2173 97.0648 109.0648 253.1951 19.5 0.2 5 G 组13 氟氢可的松 Fludrocortisone C1H29FO， 127-31-1 381.2072 325.181 239.1442 343.1915 17.7 0.2 50 14 氟米松 Flumethasone C22H28F205 2135-17-3 411.1978 253.1223 391.1519 335.1642 18.0 0.1 10 15 特戊酸氟 米松 Flumethasone pivalate C27H36F206 2002-29-1 495.2553 57.071 335.1642 LCMS-QTOF-030 27 睾丸酮 Testosterone C19H2802 58-22-0 289.2162 97.0648 109.0648 289.2162 19.2 0.1 5 28 曲安奈德 Triamcinolone acetonide C24H31FO。 76-25-5 435.2177 415.2115 397.2010 399.1591 18.4 0.3 5 1 班布特罗 Bambuterol hydrochloride C18H29N305 81732-46-9 368.218 294.1448 312.1554 72.0444 16.0 0.2 10 2 羟甲基克仑 特罗 Hydroxymethyl clenbuterol C12H18ClN202 38339-18-3 293.0818 275.0713 203.0132 132.0682 14.9 0.0 10 3 克伦塞罗 Clencyclohexerolhvhydrochloride C14H20CIN202 1435934-75- 0 319.0975 301.0869 203.0132 81.0670 14.6 0.2 5 4(暂无中文名) Clenhexerol C14H22CI2N20 38339-23-0 305.1183 203.0132 132.0682 85.1012 16.7 0.3 10 5 异克伦潘特 Clenisopenterol hydrochloride C13H21CIN20 1435935-00- 4 291.1027 273.0920 217.0289 188.0024 16.4 0.4 5 克伦潘特 Clenpenterol hydrochloride 37158-47-7 291.1026 203.0137 273.0920 132.0682 16.1 0.3 10 7 克伦普罗 Clenproperol C1H16CI2N20 38339-11-6 263.0713 245.0607 203.0132 132.0682 15.0 3.2 10 8 H 非诺特罗 Fenoterol hydrobromide C17H21NO4 13392-18-2 304.1543 135.0804 286.1438 107.0491 13.8 0.1 5 9 福莫特洛 Formoterol fumaratedihydrate C19H24N204 183814-30-4 345.1809 327.1703 149.0961 121.0608 15.5 0.1 5 10保泰松乙酸酯 Pirbuterol acetate C14H24N20s 65652-44-0 241.1546 167.0815 149.0709 122.0600 11.9 0.5 5 11 莱克多巴胺 Ractopamine hydrochloride C18H23NO3 90274-24-1 302.1751 284.1645 121.0648 91.0542 14.8 0.3 10 12 利托君 Ritodrine hydrochloride C17H21NO3 23239-51-2 288.1594 270.1489 121.0648 150.0913 14.1 0.0 5 13 沙美特罗 Salmeterol C25H37NO4 89365-50-4 416.2795 398.2690 380.2584 232.1696 18.1 0.1 5 14 索他洛尔 Sotalol hydrochloride C12H20N203S 959-24-0 273.1267 255.1162 213.0692 133.0760 12.3 0.5 10 15 特布他林 Terbutaline hemisulfate salt C12H19NO： 23031-32-5 226.1438 152.0706 170.0812 208.1332 12.5 0.1 10 16 妥布特罗 Tulobuterol CHigCINO 41570-61-0 228.115 154.0413 172.0524 118.0651 15.8 0.2 5 1对乙酰氨基酚 Acetaminophen CgH，NO， 103-90-2 152.0706 110.0600 93.0330 65.0386 13.2 4.7 50 2 氯丙嗪 Chlorpromazine C17H19CINS 50-53-3 319.103 86.0964 58.0651 246.0139 18.2 0.4 5 3 氯羟吡啶 Clopidol 1 卡马西平 Carbamazepine C15H12N20 298-46-4 237.1022 194.0964 220.0757 179.0730 17.9 0.2 5 2 苯海拉明 Diphenhydramine C17H21NO 58-73-1 256.1696 167.0855 152.0621 141.0699 16.9 0.5 5 J 3 氟西汀 Fluoxetine C17H18F3NO 549910-89-3 310.1413 44.0495 148.1121 17.8 0.2 5 组4 丙咪嗪 Imipramine C19H24N2 50-49-7 281.2012 86.0964 58.0651 208.1121 17.7 0.4 5 5 舒必利 Sulpiride C15H23N304S 15676-16-1 342.1482 112.1121 214.0162 58.0651 12.6 0.7 10 6 吡唑坦 Zolpidem C19H21N30 82626-48-0 308.1757 235.123 263.1179 92.0495 15.9 0.4 5 咖啡因 Caffeine CgH10N40， 58-08-2 195.0877 138.0662 110.0713 69.0447 14.9 1.1 5 K2 可待因 Codeine C18H21NO： 76-57-3 300.1594 165.0699 199.0754 58.0651 13.5 0.4 10 组 3 1，7-二甲基 黄膘呤 1，7-Dimethylxan- thine C7H8N402 611-59-6 181.072 124.0505 96.0556 55.0291 13.9 0.2 50 1 氯普鲁卡因 Chloroprocaine C13H19CIN202 133-16-4 271.121 100.1121 154.0049 198.0316 14.3 0.7 10 2 辛可卡因 Cinchocaine C20H29N302 85-79-0 344.2333 271.1441 215.0815 74.0964 17.9 0.3 5 3 利多卡因 Lidocaine C14H22N20 137-58-6 235.1805 86.0964 58.0651 15.0 0.6 10 组4 普鲁卡因胺 Procainamide C13H21N30 51-06-9 236.1757 163.0866 120.0444 92.0495 11.7 2.3 5 5 普鲁卡因 Procaine C13H20N202 59-46-1 237.1598 100.1121 120.0444 164.0706 13.2 1.2 5 6 丁卡因 Tetracaine C15H24N，O， 94-24-6 265.1911 176.107 72.0808 220.1332 16.8 0.7 5 1 溴苯那敏 Brompheniramine C16H19BrN2 86-22-6 319.0804 274.0226 167.0730 194.0964 16.6 0.2 10 2 西替利嗪 Cetirizine C21H25CIN203 83881-51-0 389.1627 201.0465 187.1077 166.0777 18.1 0.2 10 3 氯苯那敏 Chlorpheniramine C16H19CIN2 132-22-9 275.1313 230.0731 167.0730 202.0418 16.4 0.5 10 M 组4 氟奋乃静 Fluphenazine C22H26F3NOS 69-23-8 438.1821 171.1492 143.1179 280.0402 18.6 0.5 10 5 羟嗪 Hydroxyzine C21H27CIN202 68-88-2 375.1834 201.0465 173.1284 166.0777 17.8 0.2 10 6 异丙嗪 Promethazine C17H20NS 60-87-7 285.142 86.0964 198.0372 240.0842 17.5 2.3二级高分辨质谱库建立 配制 100 ng/mL 150 种兽药混合标准样品溶液，按照前述条件进行前处理，上机分析。进行一级 MS 扫描，以及 MS/MS(DDA)扫描，获得不同碰撞能(10V、20V、30V、40V、50V、60V)下的二级质谱图，使用LabSolutions insight 软件进行二级质谱库的建立。150种兽药高分辨二级质谱库收载了1507张二级质谱图，以及化合物的中英文名、分子式、保留时间、色谱条件，一级高分辨质荷比等信息。 图2150种兽药二级质谱库预览 2.4尿液样品加标鉴别与确认 按照前述分析条件，制备 100 ng/mL尿液加标样品(样品编号“qc80_008”)，根据保留时间及精确质量数进行鉴别，二级质谱库或典型二级碎片离子丰度比进行确认。以氟奋乃静为例演示加标样品的定性过程，基质混标中氟奋乃静 m/z438.1821 色谱出峰时间 RT=18.433 min，加标样品中m/z438.1821色谱出峰时间RT=18.014 min， 可初步判定加标样含有氟奋乃静。利用岛津LabSolutions Insight Explore 的谱库检索功能，对m/z438.1821的二级质谱图进行谱库匹配，相似度得分97分如图4所示。典型碎片离子 m/z 143.1174、m/z 171.1489、m/z 280.0404与标准谱库中质量偏差小于5 ppm， 优标标准要求10 ppm，如表3所示。 图3m/z 438.1821 提取离子流图 图44m/z 438.1821二级质谱图谱库检索结果 表3 m/z 438.1821二级质谱图典型碎片离子质量偏差 化合物 典型二级碎片离子1 典型二级碎片离子2 典型二级碎片离子3 标准谱库 143.1179 171.1492 280.0402 加标样品 143.1174 171.1489 280.0404 质量偏差 3.49 ppm 1.75ppm 0.71 ppm 2.5加标回收率 100 ng/mL 尿液加标样品进行计算加标回收率，回收率结果如图5所示，106个化合物的加标回收率在70%-120%之间，35个化合物回收率>120%，7个化合物回收率在50-70%之间，仅2个化合物(塞克硝唑、保泰松乙酸酯)回收率低于50%。 图5回收率结果 结论 本文采用岛津公司LCMS-9030 超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱联用仪，建立了尿液中150种兽药鉴别与确认的方法，同时创建了二级质谱库。方法检出限为 0.03~39.5 ng/mL， 灵敏度高。一级质谱质量数准确度误差小于5.0 ppm， ：二级质谱库匹配度好。该方法简便、灵敏、定性筛查准确性好，适用于尿液中多兽药残留的快速定性筛查。 岛津应用云 本文采用岛津公司LCMS-9030超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱联用仪，建立了尿液中150种兽药鉴别与确认的方法，同时创建了二级质谱库。方法检出限为0.03   ~39.5 ng/mL，灵敏度高。一级质谱质量数准确度误差小于5.0   ppm，二级质谱库匹配度好。该方法简便、灵敏、定性筛查准确性好，适用于尿液中多兽药残留的快速定性筛查。