盐酸多西环素片中多西环素、4-epi多西环素、甲烯土霉素、多西环素有关物质A检测方案(液相色谱仪)

SSL-CA19-130Excellence in Science Excellence in ScienceLC-182 岛津企业管理(中国)有限公司分析中心Shimadzu(China)CO.，LTD. Analytical Applications Centerhttp：//www.shimadzu.com.cn上海市徐汇区宜州路180号B2栋咨询电话：021-34193996Hotline：021-34193996Building B2， No.180 Yizhou Road， Shanghai 岛津NexeraLC-40分析盐酸多西环素中的有关物质 LC-182 摘要：本文参考美国药典 (USP)，采用岛津Nexera LC-40高效液相色谱仪，建立了盐酸多西环素中有关物质分析的超高效液相色谱测定方法。方法采用 Shim-pack Scepter C8-120 (2.1 mm l.D.×50mm L.， 1.9um)，以甲醇-水(含磷酸二氢钾、EDTA·Na2、三乙胺，氢氧化钠调节 pH=8.5) 为流动相， 0.6 mL/min 的流速进行梯度洗脱，检测波长为350 nm。分析结果表明：该方法测定基线噪音良好，通过 LabSolutions 软件设置系统适应性考察，自动出具报告；标准溶液连续测定6次，多西环素峰面积的 RSD 为 2.05%，仪器稳定性好。多西环素片剂测定结果显示多西环素与多西环素杂质A、多西环素杂质A与 4-epi多西环素分离度均>1.5，满足测定需求。 关键词： Nexera LC-40 高效液相色谱仪盐酸多西环素有关物质 多西环素 (Doxycycline) 又名强力霉素或脱氧土霉素，是一种半合成的抗生素，临床上作为广谱抑菌剂，高浓度时具有杀菌功能。该药品以发酵产生的土霉素为原料，经氯代、脱水、催化氢化、转化和成盐等单元反应制备而成。药典将从起始原料带入、生产过程氢化反应不完全、反应副产物等杂质，如：杂质A-6-表多西环素 (6-epidoxycycline)、杂质B-甲烯土霉素 (metacycline)、杂质C-4-表-多西环素(4-epidoxycycline)、杂质D-4、6-表多西环素(4、6-epidoxycycline)、杂质E-土霉素(oxytetracycline)、杂质F-2-acetyl-2-decarbamoyldoxycycline 等有关物质。因其疗效低、毒性大，各国药典对有关物质的含量进行了限定。 《中国药典》2015版规定，杂质A和B面积不得大于对照溶液主峰面积(2.0%)，其他单个杂质峰面积不得大于主峰的0.5倍(1.0%)，各杂质峰面积之和不得大于对照溶液主峰面积的2倍(4.0%)。美国药典(USP)采用主成分自身对照法，限定杂质C的限量<0.5%，未知杂质之和<0.5%，总杂质<2.0%。 文献报道，四环素类抗生素会发生光降解，在高温、强酸、强碱、氧化条件下稳定性差。 USP 采用了超高效液相色谱法，分析时间更短，样品稳定性更好，流动相消耗更少。 本实验参考USP药典，使用岛津Nexera LC-40高效液相色谱仪，以亚2 um填料色谱柱进行分离，建立了盐酸多西环素中有关物质的分析方法。NexeraLC-40 高效液相色谱仪是岛津公司2019年推出的液相新产品，该产品秉承了岛津一直以来的设计理念，同时还引入了智能分析(AI)、智能物联 (loT)等尖端技术。Nexera LC-40 系统耐压70 Mpa， 可满足大部分超高效液相分析需求。自动进样器 SIL-40CXR采用空气循环式控温，更均匀，有效避免样品降解，配置的二极管阵列检测器 SPD-M40具有极高的灵敏度和卓越的线性范围(2.5AU)，三重控温技术能有效降低基线噪音并提供稳定的基线，因此，即使在高浓度的样品中，也能准确定量检测痕量的杂质组分，可为有关物质分析提供参考。 1.1仪器 本实验采用岛津Nexera LC-40 液相色谱仪，包括 CBM-40A Lite 系统控制器， DGU-405脱气机， LC-40B XR输送泵， SIL-40CXR自动进样器， CTO-40S 柱温箱， SPD-M40A 检测器， LabSolutions Ver. 5.97 色谱工作站。 图1岛津NexeraLC-40高效液相色谱仪 1.2分析条件 色谱柱： Shim-pack Scepter C8-120 (2.1 mm i.d.×50mm L.， 1.9um) 流动相：A，水(每升含3.1g磷酸二氢钾、0.5gEDTA·Na2、0.5mL三乙胺，氢氧化钠调节 pH=8.5)； B，甲醇 流速：0.6 mL/min 柱温：60℃ 检测波长：350 nm 进样体积：5uL 洗脱方式：梯度洗脱，时间程序如表1所示。 表1梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 0.01 Pumps Pump B Conc. 10 2.00 Pumps Pump B Conc. 40 4.00 Pumps Pump B Conc. 10 9.00 Controller Stop |样品前处理 样品：盐酸多西环素片(市售，规格：0.1g，批号：20190204，有效期至2022.01) 稀释剂：0.01M 盐酸 系统适应性储备溶液1：1mg/mLβ-多西环素和盐酸甲烯土霉素，溶剂为0.01M盐酸。 系统适应性储备溶液 2：1.2 mg/mL 盐酸多西环素，溶剂为0.01M盐酸 系统适应性溶液：取5mL系统适应性储备溶液2至25mL容量瓶，加热60 min，加热至干燥，小心不要烧焦，将残留物溶解在稀释剂中，加入0.5 mL 系统适应性储备溶液1，以稀释剂定容。过滤。这份溶液包括4-epi 多西环素、多西环素有关物质A、甲烯土霉素以及多西环素，可以保存14d。 样品溶液：0.25mg/mL多西环素，稀释剂溶解。操作流程，取不少于20片剂研钵磨粉，取一部分至容量瓶，加50%稀释剂，超声 5 min， 振摇 15 min， 定容。过 0.22um 滤膜。 标准溶液：1.5 ug/mL， 取适量多西环素标准品，超声溶解，稀释剂定容。 分离度：>1.5， 4-epi 多西环素和甲烯土霉素；>1.5， 4-epi多西环素、多西环素有关物质A； >1.5，多西环素有关物质A和多西环素。 相对标准偏差：<5.0%多西环素峰，标准溶液。 |结果与讨论 3.1系统适应性考察 岛津LabSolutions软件拥有丰富智能的批处理功能，可以实现系统适应性的自动判别，省去了繁琐的人工核验。在方法中设置系统适应性参数，并在批处理中选择相应的判定条件，系统适应性通过则继续样品分析，否则暂停分析。批处理运行后，自动输出一份系统适应性考察结果的 HTML文件，如图2所示。由图2所知，标准溶液连续分析6次，多西环素峰面积相对标准偏差 (RSD) =2.05%， 满足 USP药典关于多西环素峰面积重复性的要求。 图2系统适应性输出结果 USP药典要求，多西环素、多西环素有关物质A、4-epi多西环素、甲烯土霉素等相邻峰之间分离度大于1.5。在采集方法中设置分离度参数，批处理分析后，即自动出具分离度的系统适应性结果，如图3所示，多西环素与多西环素有关物质A分离度为2.8，多西环素有关物质A与 4-epi多西环素之间的分离度为 1.7， 4-epi多西环素与甲烯土霉素分离度为4.8，分离度均大于1.5，满足要求。 <样品信息> 图3系统适应性输出结果 3.2色谱图 稀释剂、系统适应性溶液和标准溶液色谱图如下所示。稀释剂色谱图无干扰峰，系统适应性溶液色谱图中多西环素和杂质分离良好。 图4空白溶剂色谱图 图5系统适应性色谱图 图6标准溶隹色谱图(1.5 pg/mL) 3.3样品测定 按前述条件，制备样品溶液，并分析。结果如图7所示，多西环素、有关物质A、4-epi多西环素邻近峰之间实现了基线分离。 图7样品溶液色谱图(0.25mg/mL) ■结论 本文采用岛津 Nexera LC-40 高效液相色谱仪，建立了盐酸多西环素片中有关物质测定方法。方法采用Shim-pack Scepter C8-120 (2.1 mm l.D.×50mm L.，1.9 um)，以甲醇-水(含磷酸二氢钾、EDTA·Na2、三乙胺，氢氧化钠调节 pH=8.5)为流动相，0.6mL/min 的流速进行梯度洗脱，检测波长为350nm。分析结果表明：该方法测定基线噪音良好，通过 LabSolutions 软件进行系统适应性考察，自动出具报告；标准溶液连续测定6次，多西环素峰面积的 RSD 为2.05%，仪器稳定性好。多西环素片剂测定结果显示多西环素与多西环素杂质A、多西环素杂质A与 4-epi多西环素分离度均>1.5，满足测定需求。 LC-40高效液相色谱仪，建立了盐酸多西环素中有关物质分析的超高效液相色谱测定方法。方法采用Shim-pack Scepter C8-120（2.1 mm I.D.×50mm L.，1.9 µm），以甲醇-水（含磷酸二氢钾、EDTA·Na2、三乙胺，氢氧化钠调节pH=8.5）为流动相，0.6 mL/min的流速进行梯度洗脱，检测波长为350 nm。分析结果表明：该方法测定基线噪音良好，通过LabSolutions软件设置系统适应性考察，自动出具报告；标准溶液连续测定6次，多西环素峰面积的RSD为2.05%，仪器稳定性好。多西环素片剂测定结果显示多西环素与多西环素杂质A、多西环素杂质A与4-epi多西环素分离度均>1.5，满足测定需求。