人血清中睾酮检测方案(液质联用仪)

应用简报 Agilent临床研究Trusted Answers 使用 Agilent Ultivo 三重四极杆 LC/MS分析测定人血清中的睾酮 Yanan Yang、Victor Mandragon、Peter Stone' 安捷伦科技有限公司 Santa Clara， CA， USA 安捷伦科技有限公司 ( Mexico City， Mexico ) 本研究开发出一种使用微型 Agilent Ultivo 三重四极杆 LC/MS 定量分析血清中游离睾酮的稳定、灵敏且相对快速快分析方法。 Ultivo 设计用于解决常规分析实验室所面临的许多挑战。本研究的目的在于评估这种新型三重四极杆质谱仪(MS) 如何用于分析受研究关注的典型内源性分析物。 Ultivo 采用的创新技术使安捷伦能够减小仪器体积，同时达到与类似大型质谱系统相当的分析性能水平。VacShield 真空盾、Cyclone lon Guide 气旋离子导杆、十二极杆 Vortex Collision Cell 涡旋碰撞室和小型双曲面四极杆等仪器创新旨在最大程度提高微型仪器的定量分析性能，并提高仪器可靠性和稳定性。 Ultivo 减少了用户对系统维护的干预，使非专业质谱用户能够从容应对系统运行和维护。 Agilent MassHunter 软件简化了数据采集、方法设置、数据分析和报告， 获得了从采集到报告的最短时间，提高了实验室分析效率。本研究概述了使用 Ultivo 三重四极杆 LC/MS得到的人血清中游离睾酮的典型确认性能，概述了定量下限、色谱精度、校准线性、范围和准确度。 实验部分 液相色谱配置和参数 表1.UHPLC 配置和设置 参数 值 仪器 Agilent 1290 Infinity lI 高速泵 (G7120A) Agilent 1290 Infinity 自动进样器 (G4226A) Agilent 1290 Infinity 自动进样器温控 (G1330B)Agilent 1290 Infinity lI 高容量柱温箱 (G7116B) 进样针清洗 100%甲醇 自动进样器温度 进样量 19pL样品+1pL内标 分析柱 Agilent Poroshell120 EC-C18 液相色谱柱，2.1×50mm，2.7pm(部件号699775-902) 柱温 55°C 流动相A 含0.1%甲酸和5mM乙酸铵的水溶液 流动相B 甲醇 流速 0.5 mL/min 梯度 时间 (min) %B 0.0 604.0 955.0 955.1 60 停止时间 6分钟 后运行时间 1分钟 三重四极杆质谱仪配置和参数 表2.质谱仪仪器配置和离子源设置 参数 值 仪器 Agilent Ultivo 三重四极杆质谱仪 MS/MS模式 MRM 离子模式 正离子 干燥气温度 300°℃ 干燥气流速 8L/min 雾化器压力 50 psi 鞘气温度 380°C 鞘气流速 12 L/min 喷嘴电压 0V 正离子化的毛细管电压 3000V 碰撞池加速器电压 9V MS1/MS2分辨率 0.7/0.7 Unit 驻留时间 75 ms 分析物和内标的 MS/MS 化合物信息 表3.详细的MRM模式设置 化合物 内标 母离子(m/z) 子离子(m/z) 保留时间(min) 碎裂电压 (V) 碰撞能量 (V) 睾酮-d3 √ 292.2 97.0 1.647 min 130V 17V 睾酮 289.2 109.1 1.661 min 130V 18V 睾酮 289.2 97.0 1.661 min 130V 17V 用于基质匹配校准品的人血清购自 Golden West Biologicals(Temecula， CA)。标准品和内标购自 Cerilliant Corporation(Round Rock， TX)。样品前处理和液相色谱溶剂购自 Sigma-Aldrich (St. Louis， MO) 和 Honeywell Riedel-de Haen (Seelze，Germany)。 样品前处理 通过在阴性人血清中加标睾酮获得高浓度样品，然后通过用洁净血清连续稀释制得低浓度样品。使用500 pL 乙腈通过蛋白质沉淀对 250 pL各种样品进行提取。将样品涡旋混合1分钟，然后以10000 rpm 的转速离心4分钟。在引入液相色谱系统中之前，用500 pL 水对 500 uL 上清液进行稀释。制备浓度范围为 0.001-100 ng/mL 的11点校准曲线标样，重复三次。将足量的内标储备液直接加入每种基质标样和校准品中，使进样分析的所有类型样品均获得 25 ng/mL的一致浓度。 数据分析 采集数据并用 Agilent MassHunter 软件包 C.01.00 版对 Ultivo采集的数据进行分析。利用 Agilent MassHunter AcquisitionOptimizer 软件获得 MS/MS 离子对，以确定最佳母离子和子离子、碎裂电压和碰撞能量。进样各种化合物或内标的纯溶液(浓度为1000 ng/mL， 在流动注射模式下进样量为2pL)后，即完成分析步骤。 线性 睾酮分析物的校准浓度范围为 1 pg/mL 至100 ng/mL。利用1/x的加权因子得到睾酮化合物在整个浓度范围内表现出线性效应，在n=3的条件下，R²值高于0.999。由三批样品得到的精度数据表明，在所有校准浓度下， %RSD 变化小于5%。 图2.用1/x的加权因子得到的睾酮示例性校准曲线 采集时间(min) 图1.叠加MRM 色谱图，显示睾酮(500 pg/mL) 与 ds内标(25 ng/mL)的洗脱情况 分析灵敏度 阴性血清样品空白表明，样品中存在含量可测量的内源性睾酮。图3A 显示了空白血清中较小的睾酮响应，n=3。图3B示出睾酮加标浓度为 1 pg/mL 的阴性血清的结果。.0可以看出，这些校准品与相应基质空白的峰面积和信噪比之间存在显著差异；因此，绘制校准曲线并使用空白扣除功能进行计算。 图3.空白血清(A)和加标1 pg/mL 睾酮(T)的空白血清(B)的三次重复进样结果 本研究项目表明， Agilent Ultivo 三重四极杆 LC/MS能够在6分钟的分析周期内使人血清中浓度在1 pg/mL 至100 ng/mL范围内的游离睾酮分析得到优异的线性、精度和分析灵敏度。未来的工作中，需要评估不同供应商来源的血清和血液基质对这种分析方法的潜在干扰，以及通过更多样品前处理技术配制LC/MS 分析样己的影响。 ( 参考文献 ) 1. Analysis of testosterone and dihydrotestosterone inmouse tissues by liquid chromatography-electrospraytandem MS. Anal Biochem. 2010， 15，402(2)，121-128 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 仅限研究使用。不可用于诊断目的。 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 ( ◎安捷伦科技(中国)有限公司，2018 ) 前言本研究开发出一种使用微型 Agilent Ultivo 三重四极杆 LC/MS 定量分析血清中游离睾酮的稳定、灵敏且相对快速的分析方法。Ultivo 设计用于解决常规分析实验室所面临的许多挑战。本研究的目的在于评估这种新型三重四极杆质谱仪 (MS) 如何用于分析受研究关注的典型内源性分析物1。Ultivo 采用的创新技术使安捷伦能够减小仪器体积，同时达到与类似大型质谱系统相当的分析性能水平。VacShield 真空盾、Cyclone Ion Guide 气旋离子导杆、十二极杆 Vortex Collision Cell 涡旋碰撞室和小型双曲面四极杆等仪器创新旨在最大程度提高微型仪器的定量分析性能，并提高仪器可靠性和稳定性。Ultivo 减少了用户对系统维护的干预，使非专业质谱用户能够从容应对系统运行和维护。Agilent MassHunter 软件简化了数据采集、方法设置、数据分析和报告，获得了从采集到报告的最短时间，提高了实验室分析效率。本研究概述了使用 Ultivo 三重四极杆 LC/MS 得到的人血清中游离睾酮的典型确认性能，概述了定量下限、色谱精度、校准线性、范围和准确度。结论本研究项目表明，Agilent Ultivo 三重四极杆 LC/MS 能够在 6 分钟的分析周期内使人血清中浓度在 1 pg/mL 至 100 ng/mL 范围内的游离睾酮分析得到优异的线性、精度和分析灵敏度。未来的工作中，需要评估不同供应商来源的血清和血液基质对这种分析方法的潜在干扰，以及通过更多样品前处理技术配制 LC/MS 分析样品的影响。