血清中激素检测方案(液相色谱仪)

使用 Agilent Bond Elut Plexa SPE和 LC/MS/MS 测定血清中的激素 应用简报 生物分析，制药，临床研究 作者 摘要 Megan Juck 和 William Long 安捷伦科技有限公司 本研究开发出一种用于测定血清中的13种激素及其相应的内标的方法。首先使用 Agilent Bond Elut Plexa 固相萃取 (SPE) (30 mg， 1 mL)小柱从血清中萃取激素。在 Agilent InfinityLab Poroshell HPH-C8 色谱柱(2.1×50 mm， 2.7 pm)上将激素分离，随后通过液相色谱-串联质谱联用系统(LC/MS/MS) 进行分析。在正负离子电喷雾电离 (ESI)模式下使用1mM 氟化铵流动相分析激素，以改善两种模式下的激素响应。总体回收率在80%至105%范围内，相对标准偏差 (RSD) 介于2.8%和5.8%之间。本应用简报证明了 Bond Elut Plexa SPE 小柱能够简便且高效地测定血清中的激素。 前言 本研究开发出一种用聚合物固相萃取(SPE) 测定血清中的类固醇激素的方法。表1列出了分析的13种激素的结构和化学式。 Agilent Bond Elut Plexa具有独特的聚合物架构，且有羟基化、无保留性、不含酰胺的表面。蛋白质和脂类极少结合到聚合物表面，使得样品更干净，并降低了基质干扰效应。非极性 PS-DVB 内核非常适合保留激素等小分子。本应用简报证明了 BondElut Plexa SPE 小柱的简便易用性和有效性。 表1.所分析的13种激素的分子式和结构。包括同质量异构体对的信息 激素 分子式 结构 激素 分子式 结构 醛固酮 C21H2805 O HO OH CH. 11-脱氧皮质酮 C21H300： H.C ~0H CH. 青 皮质醇 C21H300s OH CH. HO"0H 雄烯二酮 C19H2602 H CH， CH. 青 可的松 C21H280s CH， OHIIIOH 雌酮 C18H2202 H，C 皮质酮 C21H3004 H 17a-羟基黄体酮 HO C21H3003 青 C -OHHO H HC CH 11110H CH.I H .c 青 二氢睾酮(DHT) 11-脱氧皮质醇 C21H3004 HC ~0H·10H C19H3002 HC OH .CH 日 CH. 青 青 β-雌二醇 C18H2402 H，C OH 孕酮 C21H3002 H，C ·CH. CH， HO 睾酮OHC19H2802 H，C 同质量异构体对： CH. 醛固酮和可的松 H 11-脱氧皮质酮和17a-羟基黄体酮 试剂与化学品 所有试剂均为 HPLC级级更高等级。甲醇购自 Honeywell(Muskegon， MI， USA)。水经由 EMD Millipore Milli-QIntegral 系统 (Darmstadt， Germany)纯化。试剂级甲酸(FA，部件号 G2453-85060)来自安捷伦科技公司。氟化铵购自 Sigma-Aldrich (St. Louis， MO， USA)。11-脱氧皮质酮d7 购自 Toronto Research Chemicals (Toronto，Ontario， Canada)。所有其他激素和内标均购自 Sigma-Aldrich。血清 (DC Mass Spect Gold， MSG4000) 购自 Golden West Biologicals， Inc. (Temecula，CA， USA)。血清在使用前保存于-70℃下。 仪器与材料 · Eppendorf 移液器和连续分液器 浓缩蒸发系统 涡旋器和多管涡旋器 (VWR， Radnor，PA， USA) Agilent Vac Elut SPS 24 多管装置，配备可容纳13个100 mm试管的收集架(部件号12234022) ( · Agilent Bond Elut Plexa， 30 mg， 1 mL 直管柱 (部件号12109301) ) ( 安捷伦质谱分析用的棕色螺纹口玻璃样品瓶，带书写 签(部件号5182-0716) ) ( 安捷伦固定螺口盖，带PTFE/红色硅胶隔垫(部件号 5190-7024) ) ( 安捷伦样品瓶内插管，250pL，去活玻璃，带聚合物 支脚(部件号5181-8872) ) ( 仪器 ) ( 采用 Agilent 1290 Infinity 液系色谱系统进行分析，其 中包括： ) ( · Agilent 1290 Infinity 二元泵 (G4220A) ) ( 配备Agilent 1290 FC/ALS 温控装置 (G1330B)的Agilent 1290 Infinity 高性能自动进样器(G4226A) ) ( A gilent 1290 Infinity 柱温箱 (G1316C) ) 将该液相色谱系统与配备安捷伦喷射流电喷雾离子化技术的 Agilent 6460A 三重四极杆 LC/MS/MS 系统联用。采用Agilent MassHunter 软作站软件进行所有的数据采集和分析。 样品前处理 激素混标和激素内标混合物分别采用甲醇制备。表2列出了各种分析物及其相应内标的浓度。各种内标与其相应的分析物具有相同的浓度。例如，激素混标中醛固酮的浓度为 50 ng/mL，激素混合内标中醛固酮-d4的浓度也是50 ng/mL。 表2.显示了激素和内标浓度。内标的加标浓度与母分析物浓度相同 标准品浓度， 分析物/内标 各浓度(ng/mL) 醛固酮/醛固酮d4 50 皮质醇/皮质醇d4 50 可的松/可的松d8 50 皮质酮/皮质酮d4 50 11-脱氧皮质醇/11-脱氧皮质醇d5 50 β-雌二醇/β-雌二醇d5 500 睾酮/睾酮d3 50 11-脱氧皮质酮/11-脱氧皮质酮 d7 50 雄烯二酮/雄烯二酮C3 50 雌酮/雌酮d3 500 17a-羟基黄体酮/17a-羟基黄体酮 d8 50 DHT/DHT d3 500 孕酮/孕酮d9 50 样品预处理 在施用 SPE 方案之前，将400 pL 0.5%甲酸 (FA)水溶液加入到 100 pL 血清中。向样品中添加20pL 激素混标和20 pL 激素内标混合物。β-雌二醇、β-雌二醇 d5、雌酮、雌酮 d3、DHT 和 DHT d3 的最终浓度为100 ng/mL。血清中的所有其他激素和内标的最终浓度均为10 ng/mL。对样品进行涡旋混合和离心以除去所有血清颗粒。 SPE 之后，在40℃下将收集的洗脱液氮吹干，然后复溶于100 pL 50/50 甲醇/水中。对样品进行涡旋混合，并将其转移至带带璃内衬管的样品瓶中进行 LC/MS/MS分析。 SPE 方案 3-5秒)，收集所有洗脱液 图1.使用 Agilent Bond Elut Plexa 30 mg， 1 mL小柱测定激素的 SPE 方案 参数 值HPLC色谱柱： Agilent InfinityLab Poroshell HPH-C8，2.1 mm x50 mm， 2.7 um (部件号699775-706)保护： Agilent InfinityLab Poroshell HPH-C8，UHPLC保护柱， 2.1mmx5 mm， 2.7 pm(部件号821725-922)流动相： A) 1 mM 氟化铵水溶液B) 乙腈(ACN)流速： 0.4 mL/min柱温： 40°℃自动进样器温度： 4C进样量： 10 pL进样针清洗： 1：1：1：1乙腈/甲醇/异丙醇/水，含0.2%甲酸梯度： 时间 (min)8停止时间： 10分钟后运行时间： 1分钟MS电喷雾电离(ESI)干燥气温度： 250°C干燥器流速： 11L/min雾化器压力： 35 psi鞘气温度： 350°℃鞘气流速： 11 L/min毛细管电压： 正离子模式，3000V；负离子模式，3500V喷嘴电压： 正离子模式，OV；负离子模式， 1800 VDelta EMV (+)： 300V 表3.目标分析物的LC/MS/MS dMRM 参数和保留时间 子离子 RT 母离子 碎裂电压 定量离子 CE 定性离子 分析物 (min) (m/z) (V) (m/z) (V) (m/z) 电离模式 醛固酮 1.55 361.2 100 343.2 15 315.2 16 正离子 皮质醇 1.98 363.2 105 121.1 24 91.1 72 正离子 可的松 2.05 361.2 133 163.1 24 121 32 正离子 皮质酮 3.01 347.2 110 329.2 12 121 24 正离子 11-脱氧皮质醇 3.22 347.2 133 109.1 28 97.1 24 正离子 β-雌二醇 4.02 271.17 158 145.1 44 143 64 负离子 睾酮 4.17 289.2 104 109.1 24 97.1 24 正离子 11-脱氧皮质酮 4.51 331.2 133 109.1 28 97.1 24 正离子 雄烯二酮 4.70 287.2 84 109.1 24 97.1 20 正离子 雌酮 4.77 269.15 158 145.1 44 143 64 负离子 17a-羟基黄体酮 5.01 331.2 133 109.1 28 97.1 24 正离子 DHT 5.34 291.2 158 255.1 8 77.1 80 正离子 孕酮 6.82 315.2 104 109.1 24 97.1 24 正离子 表4.内标的LC/MS/MS dMRM 参数和保留时间 RT 母离子 碎裂电压 定量离子 CE 分析物 (min) (m/z) (V) (m/z) (V) 电离模式 醛固酮d4 1.54 365.4 100 347.2 15 正离子 皮质醇d4 1.97 367.24 104 121 24 正离子 可的松d8 2.02 369.25 143 169.1 24 正离子 皮质酮d4 3.01 363.2 105 121 24 正离子 11-脱氧皮质醇 d5 3.20 352.26 133 100.0 24 正离子 β-雌二醇d5 4.02 276.2 150 147.1 35 负离子 酮 d3 4.13 292.2 104 97.1 24 正离子 11-脱氧皮质酮 d7 4.51 338.27 84 100.1 20 正离子 雄烯二酮1C3 4.70 290.4 104 100.1 20 正离子 雌酮 d3 4.77 272.19 158 148.1 40 负离子 17a-羟基黄体酮d8 4.96 339.28 138 100.1 28 正离子 DHT d3 5.31 294.25 120 258.2 12 正离子 孕酮d9 6.75 324.29 104 100.1 24 正离子 5.45.65.86.0 6.26.46.66.87采集时间(min) 图2.所分析的血清中13种激素的最终 dMRM 色谱图(A)，其中放大图(B)显示β-雌二醇和雌酮。浓度列于图例中 图3.所分析的血清中的13种激素内标的最终 dMRM 色谱图(A)， 其中放大图(B)显示β-雌雌醇d5和雌酮 d3.浓度列于图例中 结果与讨论 LC/MS/MS 优化 SPE优化 在开发 SPE 方法时，重要的是使用足够强的清洗溶剂去除基质干扰物，同时确保目标分析物仍然保留在小柱上。通过收集并分析由各种候选清洗溶剂(100%水、10%甲醇水溶液、20%甲醇水溶液等)得到的清洗洗脱液，，可测定激素损失。经过评估后，选择30%甲醇水溶液作为本方案的最佳清洗溶剂。 在初始 LC/MS/MS方法开发过程中，分析了11种激素：醛固酮、皮质醇、可的松、皮质酮、11-脱氧皮质醇、雄烯二酮、11-脱氧皮质酮、睾酮、17a-羟基黄体酮、DHT(负离子模式)和黄体酮。随后将两种负离子模式分析物(β-雌二醇和雌酮)加入该方法中，但它们不包括在方法开发的色谱图中。 与清洗步骤一样，也可以对洗脱溶剂进行优化。洗脱步骤的目标是选择一种最佳溶剂，该溶剂极性强到足以洗脱所有目标分析物，同时又不会洗脱在 SPE 过程中可能保留在吸附剂上的基质干扰物。本应用简报对80%甲醇水溶液、90%甲醇水溶液、100%甲醇和50/50甲醇/乙腈洗脱溶剂进行了评估。使用100%甲醇洗脱溶剂得到的激素回收率最高，因此将其用于本应用中。 对 Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C8色谱柱(2.1×50mm， 2.7pm) 与 Agilent InfinityLab Poroshell 120EC-C18色谱柱(2.1×50 mm， 2.7 pm)进行比较(图4)。EC-C8所具有的较短的烷基链为激素提供了稍短的保留时间，同时仍可分离所有同质量异构体对。 条件 流动相A： 水+0.1%甲酸 总运行时间： 10 min + 1 min 后运行时间 流速： 图4.使用 Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C8 和EC-C18色谱柱得到的11种激素(100 ng/mL)的分离和保留时间的比较。在生成该色谱图后将β-雌二醇和雌酮加入最终方法中，因此这两种化合物不包括在此色谱图中 大多数硅胶基液相色谱柱都不建议使用pH高于8或9的流动相，因此本研究使用 Agilent InfinityLab PoroshellHPH-C8 色谱柱进行评估。该色谱柱能够在 pH 高达11的条件下保持稳定，还具有与 InfinityLab Poroshell 120EC-C8 色谱柱非常相似的选择性。因此，利用 InfinityLabPoroshell HPH-C8 色谱柱对氢氧化铵和氟化铵这两种类型的流动相进行方法优化，并选为最终的分析方法。氟化铵(1mM)流动相可得到最高的分析物响应，因此将其用于最终色谱方法中。 条件 流动相A： 0.1%甲酸水溶液或0.02%氢氧化铵水溶液流动相B： 甲醇梯度程序： 0-9 min：流动相B由40%增至60%9-11 min：流动相B由60%增至95%总运行时间： 12 min +1 min 后运行时间流速： 0.4mL/min进样量： 10pL 6 采集时间(min) 图5.使用 Agilent InfinityLab Poroshell HPH-C8， 2.1 mmx50 mm， 2.7 pm 色谱柱并以0.1%甲酸水溶液(绿色迹线)和0.02%氢氧化铵水溶液(红色迹线)作为流动相得到的100 ng/mL 激素样品的色谱图。为便于对比，采用相同的LC/MS/MS 梯度。生成这些色谱图后加入β-雌二醇和雌酮，因此这两种化合物不包括在该色谱图中 条件 流动相A： 1mM 氟化铵水溶液或 0.02%氢氧化铵水溶液 流动相B： 甲醇 梯度程序： 0-9min：流动相B由40%增至60% 9-11 min：流动相B由60%增至95% 总运行时间： 12 min + 1 min 后运行时间 流速： 0.4mL/min 进样量： 10 pL ×105 采集时间(min) 图6.使用1mM氟化铵水溶液(黑色迹线)和0.02%氢氧化铵水溶液(红色迹线)得到的100 ng/mL 激素样品的总离子流色谱图。使用 Agilent InfinityLab Poroshell HPH-C8， 2.1 mm x 50 mm， 2.7 pm。为便于对比，采用相同的 LC/MS/MS 梯度。生成这些色谱图后加入β-雌二醇和雌酮，因此这两种化合物不包括在该色谱图中 图7.利用以下三种流动相得到的 DHT (100 ng/mL；负离子模式)的 MRM 叠加色谱图：1mM氟化铵水溶液(黑色)，0.02%氢氧化铵水溶液(红色)和0.1%甲酸水溶液(绿色)。使用 Agilent InfinityLab Poroshell HPH-C8，2.1mmx50 mm， 2.7 um。梯度条件列于图5和图6的说明中 回收率与重现性 使用上述 SPE 方案萃取预加标血清样品和空白样品，评估回收率和重现性。在血清样品中预加标浓度为100 ng/mL的 β-雌二醇、雌酮和 DHT。其余10种激素的预加标浓度为 10 ng/mL。使用 SPE 方案对空白样品和加标血清样品进行萃取。在最终吹干之后，在空白样品中后加标浓度为 10 和 100 ng/mL 的标准品，如前文所述。比较预加标样品和后加标样品(n=5)的平均峰面积，测定百分回收率和RSD 值。 表5.列出了百分回收率和 RSD值(在括号内示出)，n=5 分析物 加标浓度(ng/mL) %回收率 (RSD) 醛固酮 10 94(5.8) 皮质醇 10 102(5.4) 可的松 10 99(5.7) 皮质酮 10 97(5.1) 11-脱氧皮质醇 10 97 (3.9) β-雌二醇 100 81 (5.3) 睾酮 10 86(3.3) 11-脱氧皮质酮 10 91(4.6) 雄烯二酮 10 92(4.7) 雌酮 100 80(3.9) 17a-羟基黄本酮 10 105(4.2) DHT 100 88(2.8) 孕酮 10 90(4.0) 本研究开发出一种使用 Agilent Bond Elut Plexa SPE小柱测定血清中的13种激素及其相应内标的方法。通过加入1mM氟化铵，在 Agilent 6460 三重四极杆LC/MS/MS 的正负离子模式下，分析物的响应均获得很大增加。采用 Agilent InfinityLab Poroshell HPH-C8(2.1 mmx 50 mm， 2.7 um) 色谱柱可快速完成分析，使三对同质量异构体得到基线分离，获得更高重现性的积分和定量。此外，该色谱柱适用的 pH 范围较宽，是方法开发的理想色谱柱。本文所述的方法提供了优异的回收率 (80%-105%)和较低的 RSD 值(2.8%-5.8%)。Agilent Bond Elut Plexa SPE 产品几乎无需方法开发，且简便易用，因此是生物分析的理想选择。 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线：800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价：www.agilent.com/chem/erfq-cn ( 1. Fu，R.； Zhai， A. Determination of Hormones in Drinking Water by LC/MS/MS Using anAgilent InfinityLab Poroshell HPH Column (EPA 539) (使用Agilent InfinityLab Poroshell HPH 色谱柱和 LC/MS/MS测定饮用水中的激素 (EPA 539))；应用简报，安捷伦科技公司， 出版号 5991-6995EN，2016 ) ( 2. Hindle， R . Improved Analysis of Trace Hormonesin Drinking Water by LC/MS/MS (EPA 5 3 9) using the Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/M S (使用 Agilent 6460 三重四极杆液质联用系统和 LC/MS/MS 改善饮用水中痕量激素的分析(EPA 539))；应用简 报，安捷伦科技公司，出版号5991-2473EN， 2013 ) 3. Fiers， T.； Casetta， B.；Bernaert， B.； Vandersypt， E.；Debock， M.； Kaufman， J. Development of a highlysensitive method for the quantification of estroneand estradiol in serum by liquid chromatographytandem mass spectrometry without derivatization.Journal of Chromatography B. 2012，893-894，57-62 更多信息 这些数据仅代表典型的结果。有关我们的产品与服务的详细信息，请访问我们的网站 www.agilent.com。 www.agilent.com 仅限研究使用。不可用于诊断目的。 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 本资料中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 ◎安捷伦科技(中国)有限公司，2017 2017年5月2日，中国印刷 5991-8042ZHCN Agilent Technologies Agilent Technologies 摘要本研究开发出一种用于测定血清中的 13 种激素及其相应的内标的方法。首先使用 Agilent Bond Elut Plexa 固相萃取 (SPE) (30 mg, 1 mL) 小柱从血清中萃取激素。在 Agilent InfinityLab Poroshell HPH-C8 色谱柱 (2.1 ×50 mm, 2.7 μm) 上将激素分离，随后通过液相色谱-串联质谱联用系统(LC/MS/MS) 进行分析。在正负离子电喷雾电离 (ESI) 模式下使用 1 mM 氟化铵流动相分析激素，以改善两种模式下的激素响应。总体回收率在 80%至 105% 范围内，相对标准偏差 (RSD) 介于 2.8% 和 5.8% 之间。本应用简报证明了 Bond Elut Plexa SPE 小柱能够简便且高效地测定血清中的激素。前言本研究开发出一种用聚合物固相萃取 (SPE) 测定血清中的类固醇激素的方法。Agilent Bond Elut Plexa具有独特的聚合物架构，且有羟基化、无保留性、不含酰胺的表面。蛋白质和脂类极少结合到聚合物表面，使得样品更干净，并降低了基质干扰效应。非极性 PS-DVB 内核非常适合保留激素等小分子。本应用简报证明了 Bond Elut Plexa SPE 小柱的简便易用性和有效性。结论本研究开发出一种使用 Agilent Bond Elut Plexa SPE 小柱测定血清中的 13 种激素及其相应内标的方法。通过加入 1 mM 氟化铵，在 Agilent 6460 三重四极杆 LC/MS/MS 的正负离子模式下，分析物的响应均获得很大增加。采用 Agilent InfinityLab Poroshell HPH-C8 (2.1 mm × 50 mm, 2.7 μm) 色谱柱可快速完成分析，使三对同质量异构体得到基线分离，获得更高重现性的积分和定量。此外，该色谱柱适用的 pH 范围较宽，是方法开发的理想色谱柱。本文所述的方法提供了优异的回收率 (80%-105%) 和较低的 RSD 值 (2.8%-5.8%)。Agilent Bond Elut Plexa SPE 产品几乎无需方法开发，且简便易用，因此是生物分析的理想选择。