人血清中抗癫痫药物检测方案(液相色谱仪)

采用 LC/MS/MS 法同时定量分析人血清中20种抗癫痫药物 应用简报 临床研究 作者 摘要 Lauren E. Frick， Carrie J. Adler 和Vaughn P. Miller 安捷伦科技有限公司Lexington， MA 安捷伦科技有限公司 Santa Clara， CA 由于抗癫痫药物种类繁多，而且这些药物在人血清中的浓度可能差异很大，导致监测抗癫痫药物非常具有挑战性。因此，用于这些药物的高品质分析必须能够在多个数量级内同步监测多种化合物。液相色谱-质谱 (LC/MS/MS)法就特别适用于这种分析。为了定量分析人血清中20种抗癫痫药物，开发了一种灵敏度高、特异性好的方法。该方法通过一种简单的蛋白质沉淀/稀释方案配制样品。可在较宽的动态范围内定量分析物，精确度、重现性以及R值都非常出色。 Agilent Technologies 前言 液相色谱-质谱 (LC/MS/MS) 检测方法的主要优势在于其可在一次进样中同时监测多种分析物。本研究使用LC/MS/MS分析方法来定量分析人血清中的一组20种抗癫痫药物。与此相反，由于相似分析物之间的浓度差异较大，以往的分析通常只能监测少数几种化合物。该组中的化合物包括：乙酰瑞替加滨、卡马西平-10，11-环氧化物、卡马西平、10，11-二氢-10-羟基卡马西平、非氨酯、加巴喷丁、拉科酰胺、拉莫三嗪、左乙拉西坦、奥卡西平、苯巴比妥、苯妥英、普瑞巴林、瑞替加滨、卢非酰胺、噻加宾、托吡酯、丙戊酸、氨己烯酸和唑尼沙胺。分析方法使用Agilent 6460 三重四极杆质谱仪在宽浓度范围内同时检测这些化合物。各种分析物的校准浓度范围为12 ng/mL 至200000 ng/mL。高浓度范围为1.5 ug/mL至200pg/mL。 通过将药物标准品加标到空白人血清中配制样品。按照简单的蛋白质沉淀方案配制用于分析的样品和对照，然后用水稀释。进样、分离分析物、清洗色谱柱和重新平衡色谱柱在10分钟 内完成。对20个目标化合物中每个化合物(包括丙戊酸)的两个离子对进行监测。使用15个同位素标记内标来显示差异抑制，并确保色谱图定量结果的准确性和重现性。另外还对磷脂的离子对进行监测，以验证这类内源性分子的干扰最小。 校准曲线准确度在最低校准浓度下在预期浓度的20%内，在较高浓度下在15%内。重现性良好， CV 均小于15%，甚至大部分还小于 10%。所有R²值均大于0.997，其中一些化合物在浓度范围内呈现线性响应，而其他化合物则需要二次拟合。 实验部分 化学品与试剂 ( 用于基质匹配校准物的人血清购自 UTAK Laboratories (Valenci a ， CA ) 。标准 品和内标购自 Sigma-Aldrich (St. Louis， MO) 和 Cerilliant Corporation (Round Rock， T X)。样品前处理和液相色谱溶 剂购自 Sigma-Aldrich (S t . Louis， M O) 和 Honeywell R i edel-de Haen (Seelze， Germany)。 ) 样品前处理 将20种药物标准品加标到空白人血清中，得到高浓度样品。用空白血清以1：2连续稀释样品，得到7个较低浓度的样品。将 40uL样品或对照与40pL内标溶液在120pL纯甲醇中混合。将样品涡旋混合30秒后，在10000 rpm下离心10分钟。然后取50pL上清液加入450pL水中，取4pL进样到LC/MS 系统。 数据分析 ( 利用 Agilent MassHunter 采集软件 (B.08.00)进行系统控制和数据采集。 利用 MassHunter Ac q uisition Optimizer 软件获得 MS/MS离子对，在进样每种化合物或内标的纯溶液时确定最佳的母离子和碎片离子、碎裂电压和碰 撞能量。使用 Agilent MassHunter 定 量分析软件(B.08.00)和定性分析软件(B.07.00)分析数据。 ) 液相色谱配置和参数 进样针清洗 50：50 异丙醇：甲醇 自动进样器温度 4°C 进样量 4pL 保护柱 Agilent Poroshell 120 EC-C18， 2.1×5 mm， 2.7 pm 保护柱 (部件号821725-911) 分析柱 Agilent Poroshell 120 EC-C18， 2.1×100 mm， 2.7 pm 液相色谱柱 (部件号695775-902) 柱温 50 °C 流动相A 2mM乙酸铵的水溶液 流动相 B 2mM乙酸铵的甲醇溶液 流速 0.4 mL/min 梯度 时间 (min) %B 0.0 10 1.0 10 5.0 50 6.2 60 6.3 95 停止时间 7.5分钟 后运行时间 1.5分中 质谱配置和参数 配置 具有安捷伦喷射流的Agilent 6460 三重四极杆质谱仪 MS/MS模式 动态 MRM 离子模式 正离子和负离子 干燥气温度 350°C 干燥气流速 12 L/min 雾化器压力 50 psi 鞘气温度 350 °C 鞘气流速 11 L/min 喷嘴电压 0V 正离子化的毛细管电压 3500V 负离子化的毛细管电压 2500V 正离子化的A EMV 100V 负离子化的AEMV 800V 01/Q2分辨率 0.7/0.7个单位 驻留时间 可变 分析物和内标的 MS/MS 化合物信息 化合物 是否含有内标 母离子 RT 子离子1子子离子2(min) A RT (min) 碎裂电压 (V) 碰撞能量 (V) CAV 极性 10，11-二氢-10-羟基卡马西平 255.1 237.0 194.0 5.64 0.92 80 8/20 4 + 卡马西平 237.1 194.1 193.3 6.74 0.90 146 16/36 5 + 卡马西平D10 √ 247.2 204.1 6.68 0.92 152 20 4 + 卡马西平-10，11-环氧化物 253.1 210.0 180.1 5.77 0.82 94 12/28 5 + 卡马西平-10，11-环氧化物C √ 259.1 186.1 5.77 0.78 97 32 4 + 非氨酯 178.1 117.1 91.1 4.72 0.90 71 15/25 5 + 加巴喷丁 172.1 154.1 137.1 2.30 1.08 106 12/16 2 + 加巴喷丁 D10 √ 182.2 164.1 2.22 1.10 91 12 4 + 拉科酰胺 251.1 108.0 91.1 4.53 1.02 80 4/20 4 + 拉科酒胺 CD3 √ 255.3 108.0 4.51 0.92 88 4 4 拉莫三嗪 256.0 210.9 43.0 5.12 1.06 154 28/40 3 + 拉莫三嗪1c1N √ 261.0 46.0 5.12 1.02 157 48 4 + 左乙拉西坦 171.1 154.0 126.0 2.90 0.94 71 4/12 3 + 左乙拉西坦 D6 √ 177.1 132.1 2.86 1.06 71 16 4 + N-乙酰瑞替加滨 274.1 256.1 109.0 6.80 1.20 120 12/36 4 + 奥卡西平 253.1 208.0 180.0 6.03 0.82 120 16/32 3 + 奥卡西平C √ 259.1 214.0 6.03 0.70 120 16 4 + 苯巴比妥 231.1 188.1 42.0 5.17 0.86 91 8/24 2 苯巴比妥D5 √ 236.1 42.0 5.15 0.74 91 16 4 一 苯妥英 251.1 208.0 102.0 6.37 0.92 105 12/20 4 苯妥英 D10 √ 261.2 105.9 6.32 0.68 105 20 4 磷脂 184.0 184.0 4.00 8.00 250 0 3 + 普瑞巴林 160.1 142.1 55.1 2.09 1.14 89 8/24 2 + 普瑞巴林D6 √ 166.2 148.1 2.04 1.02 88 8 4 + 瑞替加滨 304.2 230.0 109.0 6.84 结果与讨论表1.高校准浓度和曲线拟合参数 线性 本方法使用 LC/MS/MS 在宽浓度范围内同时检测多种化合物(图1)。各种分析物的校准浓度范围为 12 ng/mL至200000 ng/mL。高浓度范围为 1.5 pg/mL至 200 pg/mL， 与曲线拟合参数一起在表1中给出。所有R值均大于0.997， 其中一些化合物浓浓度范围内呈现线性响应，而其他化合物则需要二次拟合(图2)。 化合物 高浓度(ug/mL) 曲线拟合 平均R(n=3) 10，11-二氢-10-羟基卡马西平 40 二次拟合 0.9998 卡马西平 50 二次拟合 0.9980 卡马西平-10，11-环氧化物 25 二次拟合 0.9998 非氨酯 80 线性 0.9987 加巴喷丁 30 二次拟合 0.9989 拉科酰胺 20 二次拟合 0.9995 拉莫三嗪 20 二次拟合 0.9992 左乙拉西坦 100 二次拟合 0.9987 N-乙酰瑞替加滨 3.5 二次拟合 0.9994 奥卡西平 5 二次拟合 0.9987 苯巴比妥 40 二次拟合 0.9988 苯妥英 40 二次拟合 0.9990 普瑞巴林 20 二次拟合 0.9996 瑞替加滨 5 二次拟合 0.9998 卢非酰胺 40 二次拟合 0.9995 噻加宾 1.5 二次拟合 0.9973 托吡酯 30 二次拟合 0.9994 丙戊酸 200 线性 0.9974 氨己烯酸 180 二次拟合 0.9996 唑尼沙胺 40 线性 0.9996 图1.显示20种化合物的洗脱情况的示例性 dMRM 色谱图 图2.分散在色谱图中具有两种极性的化合物的示例性校准曲线。所有校准曲线均采用a1/x的加权因子 准确性和重现性 校准曲线准确度在最低浓度下在预期浓度的20%内，在较高浓度下在15%内。重现性良好， CV 均小于 15%，甚至大部分还小于 10%。表2给出了同一天运行的三个重复曲线的精确度平均值和 CV值，表3给出了连续三天运行的三个重复曲线的相关值。 表2.同一天分析的曲线的准确性和重现性(n=3) 10，11-二氢-10- 卡马西平-10，11- 浓度 羟基卡马西平 卡马西平 环氧化物 非氨酯 加巴喷丁 拉科酰胺 拉莫三嗪 级别 平均值 CV 平均值 CV 平均值 CV 平均值 CV 平均值 CV 平均值 CV 平均值 CV 1 95.4 3.8 83.5 2.0 96.1 1.9 92.7 7.2 88.1 4.4 92.3 3.0 97.1 4.8 2 99.2 0.1 100.8 2.7 99.3 2.9 100.0 4.6 98.5 2.8 98.0 2.1 97.0 3.1 3 102.6 1.5 108.4 1.3 101.8 1.0 101.1 1.2 106.9 1.4 105.1 0.8 101.9 0.1 4 102.0 3.0 107.8 2.0 102.1 0.8 101.6 3.6 105.4 1.1 103.9 1.1 101.8 1.3 5 102.5 2.0 104.6 1.6 102.1 1.4 103.4 5.0 104.7 2.1 103.0 2.1 105.0 7.1 6 99.2 0.3 97.2 2.2 99.6 0.7 102.0 4.0 99.0 1.1 99.6 0.9 97.9 0.7 7 98.8 1.1 92.7 3.1 98.7 1.2 100.2 3.9 96.0 0.8 97.4 0.2 99.0 2.7 8 100.3 0.3 103.0 2.0 100.3 0.2 98.9 3.2 101.6 0.4 100.8 0.1 100.3 0.7 浓度 左乙拉西坦 N-乙酰瑞替加滨 奥卡西平 苯巴比妥 苯妥英 普瑞巴林 瑞替加滨 级别 平均值 CV 平均值 CV 平均值 CV 平均值 CV 平均值 CV 平均值 CV 平均值 CV 1 87.1 2.2 97.2 6.0 100.7 6.4 101.1 2.2 100.3 2.5 94.2 3.7 95.7 2.1 2 98.5 1.9 103.5 7.3 92.6 2.0 93.8 1.3 96.7 2.6 97.9 1.4 100.4 4.3 3 106.3 0.7 98.3 3.0 102.2 4.9 101.7 5.4 101.1 0.7 103.3 2.8 102.1 2.2 4 107.1 0.8 99.6 6.8 101.3 4.5 101.9 4.9 100.1 2.1 103.5 1.6 101.8 3.1 5 104.9 0.7 102.8 0.1 105.2 4.9 102.9 3.3 104.8 3.3 103.5 1.2 100.5 1.4 6 99.3 1.3 98.6 4.4 99.5 4.4 99.8 4.3 96.3 4.1 99.1 1.5 100.4 1.0 7 95.4 1.6 100.1 2.2 98.2 5.1 98.3 5.7 100.9 4.2 97.8 0.6 98.8 1.3 8 101.8 0.3 100.0 0.3 100.3 1.0 100.5 1.5 99.8 1.5 100.7 0.2 100.3 0.4 浓度 卢非酰胺 噻加宾 托吡酯 丙戊酸 氨己烯酸 唑尼沙胺 级别 平均值 CV 平均值 CV 平均值 CV 平均值 CV 平均值 CV 平均值 CV 1 91.9 2.7 91.3 11.7 98.4 3.5 89.0 10.2 89.6 3.6 105.1 6.7 2 99.5 1.7 98.6 13.8 96.6 2.3 97.2 3.4 101.6 1.6 96.0 2.2 3 104.5 2.1 104.2 10.0 101.1 2.3 100.5 3.4 104.4 2.2 96.2 3.4 4 103.1 0.6 109.1 9.3 102.3 3.4 101.8 7.6 104.1 2.5 99.7 1.2 5 103.0 2.8 100.1 2.4 101.9 4.6 107.2 3.5 102.3 1.2 101.5 2.8 6 99.8 1.0 96.2 7.2 101.9 0.7 104.7 2.7 99.6 0.8 101.4 2.1 7 97.4 0.5 100.6 6.7 97.1 1.4 103.2 3.0 97.8 1.1 100.8 1.7 8 100.8 0.2 100.0 1.4 100.7 0.2 96.3 2.6 100.6 0.3 99.2 1.1 表3.连续3天分析的曲线的准确性和重现性(n=3) 10，11-二氢-10- 卡马西平-10，11- 浓度 左乙拉西坦 N-乙酰瑞替加滨 奥卡西平 苯巴比妥 苯妥英 普瑞巴林 瑞替加滨 级别 平均值 CV 平均值 CV 平均值 CV 平均值 CV 平均值 CV 平均值 CV 平均值 CV 拉科酰胺 拉莫三嗪 1 84.1 4.4 98.2 6.9 97.5 8.7 97.1 6.0 95.7 5.9 93.0 5.5 94.4 2.7 平均值 CV 平均值 CV 2 101.4 3.3 101.3 3.6 97.6 3.2 99.6 5.0 96.3 2.7 100.0 2.8 100.6 4.1 91.9 4.0 92.8 8.2 3 106.6 0.7 98.0 3.0 105.0 10.0 103.2 7.8 101.3 1.8 103.9 3.1 100.9 3.2 99.0 3.2 98.7 5.4 4 107.0 2.7 105.0 2.8 97.6 5.5 98.6 5.3 106.6 5.8 101.4 2.7 103.6 4.3 105.3 1.1 102.9 0.7 5 104.6 1.9 99.3 3.1 104.1 10.4 103.4 2.2 104.4 3.3 103.8 2.5 102.8 1.5 103.1 1.5 102.4 2.4 6 99.6 0.8 96.4 2.6 98.3 5.3 98.2 2.5 96.2 1.0 99.6 1.2 98.5 1.6 103.8 1.8 107.4 7.5 7 95.2 2.4 102.1 1.8 99.7 5.9 99.7 3.6 99.2 1.9 97.7 2.6 99.0 1.7 98.0 1.4 97.4 0.9 8 101.7 0.8 99.7 0.4 100.1 1.1 100.3 1.0 100.7 0.8 100.7 0.7 100.3 0.4 98.4 1.8 97.9 3.8 8 100.2 0.4 103.4 1.4 100.4 0.5 100.4 1.1 101.6 0.9 100.6 0.5 100.7 1.0 浓度 卢非酰按 噻加宾 托吡酯 丙戊酸 氨己烯酸 唑尼沙胺 级别 平均值 CV 平均值 CV 平均值 CV 平均值 CV 平均值 CV 平均值 CV 1 88.7 5.5 93.0 13.6 100.4 5.9 91.6 14.6 89.0 2.9 101.3 8.1 2 100.7 5.4 107.1 5.5 98.6 0.9 94.6 5.1 101.7 1.2 101.0 3.7 3 104.5 2.2 97.3 5.8 101.0 2.1 99.9 2.4 104.4 2.3 98.8 1.3 4 104.3 2.0 105.9 5.4 99.1 5.9 104.4 4.7 104.3 2.7 96.9 2.4 5 105.9 2.2 98.9 5.4 100.8 5.0 106.1 6.9 102.9 0.6 98.8 4.9 6 97.5 1.6 95.4 5.5 100.7 0.9 102.6 1.6 99.4 0.5 101.9 1.6 7 97.6 1.9 102.9 3.8 99.3 4.0 104.7 2.5 97.7 1.1 102.6 2.1 8 100.9 0.5 99.5 0.9 100.2 1.0 96.1 0.9 100.6 0.3 98.5 0.4 结论 本研究开发了一种可同时定量分析人血清中20种抗癫痫药物的准确、可重现且可靠的 LC/MS/MS分析方法。但仍需进一步研究来更好地理解基质干 扰效应，该效应可能影响该组中任何药物的定量结果。另外，还需要对不同来源的流动相组分和其他来源的样品加以分析。 摘要由于抗癫痫药物种类繁多，而且这些药物在人血清中的浓度可能差异很大，导致监测抗癫痫药物非常具有挑战性。因此，用于这些药物的高品质分析必须能够在多个数量级内同步监测多种化合物。液相色谱-质谱 (LC/MS/MS)法就特别适用于这种分析。为了定量分析人血清中 20 种抗癫痫药物，开发了一种灵敏度高、特异性好的方法。该方法通过一种简单的蛋白质沉淀/稀释方案配制样品。可在较宽的动态范围内定量分析物，精确度、重现性以及 R2 值都非常出色。前言液相色谱-质谱 (LC/MS/MS) 检测方法的主要优势在于其可在一次进样中同时监测多种分析物。本研究使用 LC/MS/MS 分析方法来定量分析人血清中的一组 20 种抗癫痫药物。与此相反，由于相似分析物之间的浓度差异较大，以往的分析通常只能监测少数几种化合物。该组中的化合物包括：乙酰瑞替加滨、卡马西平-10,11-环氧化物、卡马西平、10,11-二氢-10-羟基卡马西平、非氨酯、加巴喷丁、拉科酰胺、拉莫三嗪、左乙拉西坦、奥卡西平、苯巴比妥、苯妥英、普瑞巴林、瑞替加滨、卢非酰胺、噻加宾、托吡酯、丙戊酸、氨己烯酸和唑尼沙胺。分析方法使用 Agilent 6460 三重四极杆质谱仪在宽浓度范围内同时检测这些化合物。各种分析物的校准浓度范围为 12 ng/mL 至 200000 ng/mL。高浓度范围为 1.5 μg/mL 至 200 μg/mL。通过将药物标准品加标到空白人血清中配制样品。按照简单的蛋白质沉淀方案配制用于分析的样品和对照，然后用水稀释。进样、分离分析物、清洗色谱柱和重新平衡色谱柱在 10 分钟内完成。对 20 个目标化合物中每个化合物（包括丙戊酸）的两个离子对进行监测。使用 15 个同位素标记内标来显示差异抑制，并确保色谱图定量结果的准确性和重现性。另外还对磷脂的离子对进行监测，以验证这类内源性分子的干扰最小。校准曲线准确度在最低校准浓度下在预期浓度的 20% 内，在较高浓度下在 15% 内。重现性良好，CV 均小于 15%，甚至大部分还小于 10%。所有 R2 值均大于 0.997，其中一些化合物在浓度范围内呈现线性响应，而其他化合物则需要二次拟合。结论本研究开发了一种可同时定量分析人血清中 20 种抗癫痫药物的准确、可重现且可靠的 LC/MS/MS 分析方法。但仍需进一步研究来更好地理解基质干扰效应，该效应可能影响该组中任何药物的定量结果。另外，还需要对不同来源的流动相组分和其他来源的样品加以分析。