人血浆中花青素苷代谢物检测方案(液质联用仪)

实验部分SPE 作者 ( Aman Sandhu1、In d ika E d irisinghe1、 Britt Burton-Freeman1.2以及 Jerry Zweigenbaum3 ) 1营养学研究中心，食品安全与健康研究所，伊利诺理工学院，美国伊利诺伊州 2营养学系 加利福尼亚大学戴维斯分校 美国加利福尼亚州 3安捷伦科技有限公司 2850 Centerville Road Wilmington， DE 19808 采用蛋白质沉淀与固相萃取对人血浆中的花青素苷代谢物进行UHPLC-MS/MS三重四极杆分析以确定食物中的摄取量 应用简报 食品 摘要 事实表明，生物样品的基质效应是造成液质联用 (LC/MS)方法的不稳定与不准确性的原因。在本研究中，我们开发出了一种用于分析人血浆中花青素苷代谢物的方法。此外，我们通过提取人血浆中五种不同花青素苷代谢物比较了蛋白质沉淀 (PPT)与固相萃取(SPE)这两种不同的样品前处理技术。血液样品采集自饮用草莓饮料(40g冷冻干燥草莓粉)0、2及3小时后的健康女性女愿者(年龄20-35岁)。采用 PPT方法时， 在血浆(500pL)中加入酸化乙腈(1.5mL)，然后涡旋并离心。收集上清液并用氮气吹干，以待进行三重四极杆液质联用分析。采用 SPE 技术时，先将稀释后的血浆样品加载至 SPE 管(Agilent Bond Elut Plexa， 3 mL)中，然后用水冲洗，最后收集酸化甲醇的洗脱液。将收集的洗脱液在氮气下吹干，以待进行三重四极杆液质联用分析。采用三重四极杆液质联用系统对花青素苷类/代谢物(矢车菊素-3-葡萄糖苷 (C3G)、矢车菊素-3-芸香糖苷(C3R)、天竺葵素-3-葡萄糖苷 (P3G)、天竺葵素-3-芸香糖苷 (P3R) 及天竺葵素葡糖苷酸(PG))进行鉴定与定量分析。 在样品前处理流程后加入与基质匹配的标准品，用此进行分析，这些代谢物可获得出色的线性和检测限。在饮用后2小时可观察到花青素苷代谢物达到浓度峰值。与 PPT的样品相比， SPE 的样品中 P3G 和PG含量明显更高(p<0.05)。然而， C3G、C3R和P3R 的含量在这两种技术之间并没有差异。取决于化合物的不同，这两种方法的化合物回收率范围分别为4.2%-18.4%(PPT)与60.8%-121.1%(SPE)。结果表明采用 SPE 的样品前处理方法可使浓缩的花青素苷代谢物具有更高回收率。 前言 花青素苷类属于黄酮类的多酚物质。它们在浆果、苹果、卷心菜、玉米、葡萄、土豆等红色、蓝色或紫色水果和蔬菜中含量丰富。它们不仅会使水果与蔬菜呈现鲜艳的红/紫色，而且还对种子传播和授粉具有重要作用。花青素苷类的基本结构包括黄详盐阳离子(C6-C3-C6)， 这一结构可与不同的糖、羟基或甲基连接形成不同类型的花青素苷类。此外，糖残基可被芳香酸/脂肪酸酰化[1]。花青素苷类的糖苷配基(不含糖)称为花青素类，其中六种主要类别为矢车菊素、芍药素、花翠素、天竺葵素、锦葵色素及牵牛花色素[2]。摄入富含花青素苷类的饮食对健康有益，对高血压、心血管疾病、糖尿病、肥胖及增龄性神经退行性障碍等一些疾病具有预防作用[3]。 在浆果中，草莓是花青素苷类的主要来源。根据种类的不同，草莓中总花青素苷的含量为20-60mg/100 g鲜重[4]。天竺葵素-3-0-葡萄糖苷是草莓中的主要花青素苷(83%)，随后依次是天竺葵素-3-0-芸香糖苷(8%)及矢车菊素-3-0-葡萄糖苷(7%)[4]。草莓中花青素苷类的结构如图1所示。花青素苷类能以糖苷形式被人体吸收，但其生物利用度极低。人们已开展临床试验研究不同 浆果中的花青素苷类对健康的益处。研究人员在方法开发中面临的主要挑战是这些化合物在血液中含量极低，而且它们对pH较为敏感，在酸性条件下较稳定。因此，需要采用有效的提取技术来提取血浆中的花青素苷代谢物。蛋白质沉淀 (PPT)因其低廉的成本与简单的操作成为了最常用的生物样品前处理方法，但结果通常无法确保准确性与重现性。而固相萃取 (SPE) 因其较好的回收率和重现性而越来越多地应用于 HPLC分析前的样品净化。这种技术还可用于代谢物浓缩并能减少血浆基质中其他不必要化合物的干扰。 本应用简报介绍了上述代谢物分析的方法学，其中包括PPT与SPE在提取人血浆中花青素苷类/代谢物时的比较。样品净化流程对 Agilent Bond Elut Plexa SPE 小柱与传统蛋白质沉淀方法进行了对比。 图1.草莓中存在的花青素苷类单体及相应花青素的结构 研究设计 血浆样品采集自三位女性性愿者(年龄20-35岁)。志愿者在研究开始前两天和试验期间均采用低多酚饮食。采集基底血样(0小时)后，我们为志愿者提供了草莓饮料(由40g冷冻干燥草莓粉制成)。表1展示了草莓饮料中的花青素苷类组成。分别在0、2、3小时时由肘前静脉处采集血液至预标记的 Vacutainer (3×4 mLEDTA)管中。将所得 500pL等分的血浆转移至微量离心管中，并在分析前始终保存于-80℃下。 表1. 草莓饮料(40g草莓粉)中的花青素苷类含量(mg) 矢车菊素-3-0-葡萄糖苷 17.60±0.40 矢车菊素-3-0-芸香糖苷 0.74±0.01 天竺葵素-3-0-葡萄糖苷 160.12±1.60 天竺葵素-3-0-芸香糖苷 28.66±0.24 数据为三次重复分析的平均值±标准偏差 样品前处理：血浆中花青素苷类/代谢物的提取 PPT 将血浆样品置于冰上解冻，在500 pL中加入1.5mL酸化乙腈(含1%甲酸)。将样品置于4℃冰箱中1小时，每30分钟涡旋一次。然后将样品置于4℃以1789 rcf 离心10分钟。收集上清液并在氮气下吹干。将吹干后的样品用用腈(5%浓度，含有1%甲酸)溶解、离心后制得125 pL的最终体积进行 HPLC分析。 将血浆置于冰上解冻，用1.5mL酸化水(含1%甲酸)稀释500pL样品。依次采用2mL酸化甲醇(含1%甲酸)与2mL酸化水(含1%甲酸)活化SPE 小柱 (Agilent Bond Elut Plexa， 200 mg，3mL， 部件号1219610)。在重力下将样品加载至活化后的小柱中。然后用1.5mL酸化水(含1%甲酸)冲洗SPE 小柱。用1.5mL酸化甲醇(含1%甲酸)洗脱代谢物。将收集到的洗脱液在氮气下吹干。将吹干后的样品用125 pL UHPLC初始流动相复溶、离心， 并进行 HPLC分析。 标准溶液的前处理 在样品前处理后将四种糖基化花青素苷类的标准品在样品前处理后加到空白血浆中，加入的浓度用于在研究的线性范围内建立校准曲线。只用 SPE 样品前处理方法所获得的最低浓度标准品的响应来计算检测限 (LOD) 和定量限(LOQ)。这样可得出方法的 LOD和LOQ， 是测试对象血浆样品中测得浓度的准确反映。葡糖苷酸代谢物的浓度采用天竺葵素-3-0-葡萄糖苷标准品所获得的响应进行计算，这是由于此代谢物的真正标准品无法获得。 仪器 采用Agilent 1290 Inifinity UHPLC 系统以及 Agilent 6460三重四极杆质谱仪对提取出的花青素苷类/代谢物进行分析。UHPLC包括： ( Agilent 1290 Infinity 二元泵 ( G4220A) ) ( · A Agilent 1290 Infinity 自动进样器 (G4226A) 及 Agilent 1290 Infinity 温控装置(G1330B) ) ( Agilent 1200 系列柱温箱 (G1316A) ) LC/MS/MS 分析牛件如表2所示，用于定量分析的 MRM 目标离子对如表3所示。每个离子对中的一个 MRM 时间段的驻留时间为100 ms。 表2.Agilent 6460 三重四极杆液质联用系统运行条件 液相色谱运行条件 色谱柱 Agilent Poroshell 120 Stablebond C18， 2.1mmx150 mm， 2.7 pm (部件号683775-902) 柱温 30°C 进样量 5pL 流动相 A)1%甲酸的双蒸水溶液 B) 乙腈 运行时间 22 min 流速 0.3 mL/min 梯度 初始5%B； 0-10 min B 由5%增加至15%； 15 min 时 20% B； 18 min 时 30%B； 20 min 时 90% B； 22 min 时回到5%B 三重四极杆质谱条件 表3. 用于 Agilent 6460 三重四极杆LC/MS鉴定与定量分析的花青素苷类/代谢物靶标离子对 保留时间 母离子 子离子 碰撞能量 碎裂电压 化合物 (min) (m/z) (m/z) (V) (V) 矢车菊素-3-0-葡萄糖苷 9.80 449.1 287.1 22 82 矢车菊素-3-0-芸香糖苷 10.37 595.2 287.1 38 89 天竺葵素-3-0-葡萄糖苷 11.26 433.1 271.0 18 87 天竺葵素葡糖苷酸 11.44 447.1 271.1 22 89 579.2 271.1 30 89 表4.花青素苷类的线性、LOD 和L0Q 化合物 线性 LOD (S/N=3) LOQ(S/N=10) (ng/mL) 1R2 (ng/mL) (ng/mL) 矢车菊素-3-0-葡萄糖苷 6.31-202.00 0.9999 0.30 0.50 矢车菊素-3-0-芸香唐苷 7.72-247.00 0.9999 0.50 1.50 天竺葵素-3-0-葡萄糖苷 6.47-207.00 0.9999 0.03 0.10 天竺葵素-3-0-芸香糖苷 6.56-210.00 0.9999 0.30 1.25 采用 Agilent MassHunter Optimizer 软件对 C3G、C3R、P3G和P3R标准品的碰撞能量及 MRM 离子对进行优化。PG的 MRM 离子对基于之前研究中的Q-TOF分析所得[5]。线性、LOD 及 LOQ如表4所示。通过在空白血浆中加入已知浓度标准品(低浓度加标样品为 37 ng/mL， 高浓度加标样品为74ng/mL) 以及比较在溶剂中制备的标准品响应来研究两种技术下的回收率。 0小时)中未检测到草莓花青素苷类/代谢物。PG是血浆中唯一可检测到的代谢物，而其他四种化合物是存在于草莓中的花青素苷类，无需任何转化即可被人体吸收并存在于血浆中。草莓花青素苷类/代谢物在2小时左右达到血浆峰浓度，随后在3小时时降低。饮用草莓饮料后不同花青素苷类/代谢物的浓度极低，这说明这些化合物在人体内的吸收率和生物利用度均较低。 由于采用 PPT技术时化合物可能与蛋白质发生结合/共沉淀，因此通过 SPE 获得的结果更为可靠。表6中展示了采用 SPE 和 PPT得到的花青素苷类回收率。取决于化合物的不同，这两种方法的化合物回收率范围分别为4.2%-18.4%与60.8%-121.1%。对于血浆等复杂基质的样品前处理而言， SPE 优于 PPT。结果表明 SPE有助于样品净化、回收以及及青素苷类/代谢物的浓缩。 表5.通过 PPT 和 SPE 技术从血浆中提取出的花青素苷类/代谢物对比结果，单位为 ng/mL 血浆 蛋白质沉淀(PPT)时间(小时) 固相萃取 (SPE)时间(小时) 花青素苷类/代谢物 (ng/mL) 0 2 3 0 2 3 矢车菊素-3-0-葡萄糖苷 0.07±0.00 0.25±0.06 0.21±0.01 0.07±0.00 0.23±0.15 0.24±0.06 矢车菊素-3-0-芸香糖苷 0.41±0.00 0.83±0.00 0.78±0.00 0.41±0.00 0.83±0.01 0.79±0.01 天竺葵素-3-0-葡萄糖苷 0.00±0.00 1.34±0.86 0.59±0.34 0.00±0.00 1.92±0.66 1.20±0.69 天竺葵素-3-0-芸香糖苷 0.00±0.00 0.15±0.15 0.05±0.06 0.00±0.00 0.30±0.59 0.08±0.11 天竺葵素葡糖苷酸 0.00±0.00 1.27±1.13 0.77±1.21 0.00±0.00 3.32±2.02 1.97±1.36 数据为三次重复分析的平均值±标准误差 表6.. 1通过 PPT 与 SPE 获得的花青素苷类回收率 低浓度加标样品 高浓度加标样品 低浓度加标样品 高浓度加标样品 代谢物 回收率(%) 回收率(%) 回收率(%) 回收率(%) 矢车菊素-3-0-葡萄糖苷 16.12±1.55 10.33±0.06 84.55±1.21 75.16±0.15 矢车菊素-3-0-芸香糖苷 18.35±1.57 12.04±2.71 103.82±3.19 97.3±6.26 天竺葵素-3-0-葡萄糖苷 11.21±1.79 6.79±2.14 68.7±1.42 60.84±2.37 天竺葵素-3-0-芸香糖苷 8.60±3.16 4.18±1.67 121.05±13.76 97.8±4.87 数据为四次重复分析的平均值±标准偏差 图3展示了2小时在一个受试对象体内四种母体化合物与一种代谢物的色谱分析结果。除 P3G 和 PG外，所有分析物均实现了良好分离。然而，这两种化合物母离子的差异已足以将其信号分离出来。需要注意的是，从分析物中实现完全色谱分离的另外两种化合物分别与C3R 和PG具有相同的母离子/子离子对。它们可能是相关化合物，但这一关系仅可通过 MS/MS 全谱数据进行评价。 图3. 饮用草莓饮料2小时后血浆中花青素苷类/代谢物的离子对 MRM色谱图(叠加)； C3G(矢车菊素-3-0-葡萄糖苷)、C3R(矢车菊素-3-0-芸香糖苷)、P3G(天竺葵素-3-葡萄糖苷)、PG(天竺葵素葡糖苷酸)和P3R(天竺葵素-3-0-芸香糖苷)；U(未知峰) 结论 参考文献 采用三重四极杆 LC/MS/MS分析可准确测定人血浆样品中摄入极低浓度糖基化的花青素苷类及其代谢物。采用 SPE 可提高方法的回收率、准确度和精密度。MRM的高灵敏度可提供分析所需的灵敏度和选择性。这些研究有助于深入了解促进健康的这些化合物的潜在使用情况。 ( 1. M. Horbowicz， R. Kosson， A. Grzesiuk， H. D bski. "Anthocyanins of Fruits and Vegetables -Their Occurrence， Analysis and R ole in Human Nutrition" Vegetable Crops Research Bulletin 5 (2008). ) ( 2. Y .Tanaka， N. Sasaki， A . O hmiya.“Biosynthesis of plant pigments： anthocyanins， betalains and carotenoids" The P lant journal： for cell and molecular biology 54(4)， 733-49 (2008). d oi： 10.1111/j.1365-313X.2008.03447.x. ) 3. A. Basu， et al.“Strawberry as a functional food： anevidence-based review" Critical reviews in food scienceand nutrition 54(6)， 790-806 (2014). doi： 10.1080/10408398.2011.608174. 4..FF. L. da Silva， et al. "Anthocyanin pigments in strawberry.LWT" Food Science and Technology 40(2)， 374-82(2007).doi： http：//dx.doi.org/10.1016/j.lwt.2005.09.018. 5.1.Edirisinghe， et al. “Strawberry anthocyanin and itsassociation with postprandial inflammation and insulin"Br. J. Nutr. 106(6)， 913-22(2011). doi： 10.1017/s0007114511001176. 更多信息 这些数据仅代表典型的结果。有关我们的产品与服务的详细信息，请访问我们的网站 www.agilent.com. 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价：www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知。 ◎安捷伦科技(中国)有限公司，2016 2016年3月3日， 中国出版 5991-6526CHCN Agilent Technologies Agilent Technologies 摘要    事实表明，生物样品的基质效应是造成液质联用(LC/MS) 方法的不稳定与不准确性的原因。在本研究中，我们开发出了一种用于分析人血浆中花青素苷代谢物的方法。此外，我们通过提取人血浆中五种不同花青素苷代谢物比较了蛋白质沉淀(PPT) 与固相萃取(SPE) 这两种不同的样品前处理技术。血液样品采集自饮用草莓饮料（40 g 冷冻干燥草莓粉）0、2 及3 小时后的健康女性志愿者（年龄20 - 35 岁）。采用PPT 方法时，在血浆(500 μL) 中加入酸化乙腈(1.5 mL)，然后涡旋并离心。收集上清液并用氮气吹干，以待进行三重四极杆液质联用分析。采用SPE 技术时，先将稀释后的血浆样品加载至SPE 管（Agilent Bond Elut Plexa，3 mL）中，然后用水冲洗，最后收集酸化甲醇的洗脱液。将收集的洗脱液在氮气下吹干，以待进行三重四极杆液质联用分析。采用三重四极杆液质联用系统对花青素苷类/代谢物（矢车菊素-3-葡萄糖苷(C3G)、矢车菊素-3-芸香糖苷(C3R)、天竺葵素-3-葡萄糖苷(P3G)、天竺葵素-3-芸香糖苷(P3R) 及天竺葵素葡糖苷酸(PG)）进行鉴定与定量分析。    在样品前处理流程后加入与基质匹配的标准品，用此进行分析，这些代谢物可获得出色的线性和检测限。在饮用后2 小时可观察到花青素苷代谢物达到浓度峰值。与PPT 的样品相比，SPE 的样品中P3G 和PG 含量明显更高(p < 0.05)。然而，C3G、C3R 和P3R 的含量在这两种技术之间并没有差异。取决于化合物的不同，这两种方法的化合物回收率范围分别为4.2% - 18.4% (PPT) 与60.8% - 121.1% (SPE)。结果表明采用SPE 的样品前处理方法可使浓缩的花青素苷代谢物具有更高回收率。前言    花青素苷类属于黄酮类的多酚物质。它们在浆果、苹果、卷心菜、玉米、葡萄、土豆等红色、蓝色或紫色水果和蔬菜中含量丰富。它们不仅会使水果与蔬菜呈现鲜艳的红/紫色，而且还对种子传播和授粉具有重要作用。花青素苷类的基本结构包括黄详盐阳离子(C6-C3-C6)，这一结构可与不同的糖、羟基或甲基连接形成不同类型的花青素苷类。此外，糖残基可被芳香酸/脂肪酸酰化[1]。花青素苷类的糖苷配基（不含糖）称为花青素类，其中六种主要类别为矢车菊素、芍药素、花翠素、天竺葵素、锦葵色素及牵牛花色素[2]。摄入富含花青素苷类的饮食对健康有益，对高血压、心血管疾病、糖尿病、肥胖及增龄性神经退行性障碍等一些疾病具有预防作用[3]。    在浆果中，草莓是花青素苷类的主要来源。根据种类的不同，草莓中总花青素苷的含量为20 - 60 mg/100 g 鲜重[4]。天竺葵素-3-O-葡萄糖苷是草莓中的主要花青素苷(83%)，随后依次是天竺葵素-3-O-芸香糖苷(8%) 及矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(7%) [4]。草莓中花青素苷类的结构如图1 所示。花青素苷类能以糖苷形式被人体吸收，但其生物利用度极低。人们已开展临床试验研究不同浆果中的花青素苷类对健康的益处。研究人员在方法开发中面临的主要挑战是这些化合物在血液中含量极低，而且它们对pH 较为敏感，在酸性条件下较稳定。因此，需要采用有效的提取技术来提取血浆中的花青素苷代谢物。蛋白质沉淀(PPT) 因其低廉的成本与简单的操作成为了最常用的生物样品前处理方法，但结果通常无法确保准确性与重现性。而固相萃取(SPE) 因其较好的回收率和重现性而越来越多地应用于HPLC 分析前的样品净化。这种技术还可用于代谢物浓缩并能减少血浆基质中其他不必要化合物的干扰。    本应用简报介绍了上述代谢物分析的方法学，其中包括PPT 与SPE 在提取人血浆中花青素苷类/代谢物时的比较。样品净化流程对Agilent Bond Elut Plexa SPE 小柱与传统蛋白质沉淀方法进行了对比。结论    采用三重四极杆LC/MS/MS 分析可准确测定人血浆样品中摄入极低浓度糖基化的花青素苷类及其代谢物。采用SPE 可提高方法的回收率、准确度和精密度。MRM 的高灵敏度可提供分析所需的灵敏度和选择性。这些研究有助于深入了解促进健康的这些化合物的潜在使用情况。