血浆中脂质检测方案(液质联用仪)

仪器 JeremyKoelmel 佛罗里达大学化学系 美国佛罗里达州盖恩斯维尔 Mark Sartain， Juli Salcedo， Adithya Murali， Xiangdong Li， Sarah Stow 安捷伦科技有限公司 美国加利福尼亚州圣克拉拉市 使用迭代 MS/MS 数据采集结合 LipidAnnotator 软件和 6546 LC/Q-TOF 改善血浆脂质组的覆盖范围 基于质谱的脂质组学面临的一项主要挑战是，实现对生物样品中宽浓度范围内大量不同脂质的全面表征。虽然鸟枪法脂质组学推动了脂质分析领域的发展，但它受到一些限制，包括无法区分可能具有重要生物学意义的同质异位物质，并且由于电离抑制而导致动态范围较窄。由此催生了将高效液相色谱 (HPLC)与高分辨率质谱(MS)联用的基于色谱的脂质分析方法。 为了与计算机生成的数据库进行子离子谱图匹配，可靠的脂质标注需要在 MS/MS模式下进行数据采集。然而，虽然液相色谱分离有助于阐明同分异构脂质并降低复杂性，但数据依赖型高分辨率MS/MS 数据受到色谱洗脱过程中可选择用于碎裂的母离子数量的限制。因此，在复杂样品的单次分析中无法获得所有目标 MS/MS 谱图。由于存在浓度偏差，该策略经常遗漏重要的低丰度脂质。 本应用简报展示了应对这些挑战的解决方案。我们使用反相(RP)色谱，其非常适合分离许多同分异构脂质，并且是全面分析血浆1、组织²和细胞脂质的常用方法。将这种液相色谱分离技术与 Agilent 6546 LC/Q-TOF 相结合，后者是一种专门设计用于同时提供宽动态范围和高分辨率的质谱仪，并且其分辨率不受采集速度的影响。我们还评估了全自动 Q-TOF 迭代 MS/MS 采集模式，其中对样品多次进样，并循环排除之前选择用于 MS/MS碎裂的母离子。这些结果表明，使用迭代 MS/MS 能够显著改善血浆脂质组覆盖范围。可以将迭代 MS/MS 数据用于 Agilent Lipid Annotator 软件，作为完整脂质组学工作流程的一部分。 实验部分 试剂与化学品 所有试剂和溶剂均为 HPLC 或 LC/MS级。乙腈、甲醇和异丙醇购自 Honeywell(Morristown， NJ， USA)。超纯水产自配备LC-Pak Polisher 和 0.22 um 膜式终端过滤器滤芯的 Milli-QIntegral 系统 (EMDMillipore， Billerica， MA， USA)。氟化铵和LC/MS 级乙酸铵购自 Millipore Sigma (St.Louis， MO， USA)。 NIST SRM 1950 人血浆购自 Millipore Sigma。 样品前处理 将 NIST SRM 1950 血浆置于冰上解冻，并用改进的 Folch 提取法提取血浆脂质。将甲醇(400 pL)加入含有50 pL 解冻血浆的2mL Eppendorf管中，短暂涡旋混合，然后超声水浴处理5分钟。加入氯仿(800pL)，涡旋混合1分钟。为了诱导相分配，加入240 pL 水。然后将混合物涡旋混合1分钟，并在4℃下以16000 ×g离心2分钟。用气密玻璃注射器小心取出下层，并转移到2 mL Agilent A-Line棕色玻璃样品瓶中。为再次萃取剩余的中间层和上层，加入900 pL 氯仿/甲醇/水 (86：14：1)，将混合物涡旋混合1分钟后离心。将来自两次 50 pL 提取的下层混合液混合，并利用真空浓缩仪将其干燥。将干燥的脂质提取物用 100 pL甲醇/氯仿混合物 (9：1， v/v) 复溶，涡旋混合1分钟，然后转移至250 uL 经去活处理的自动进样器玻璃内插管中，以备 LC/MS 分析。对于正离子模式分析，使用合成橡胶隔垫(部件号5181-1212)，且进样量为2 uL。对于负离子模式分析，使用PTFE/硅橡胶/PTFE隔垫(部件号5185-5861)，且进样量为5pL。 液相色谱系统 Agilent 1290 Infinity lI液相色谱系统包括：Agilent 1290 Infinity II高速泵 (G7120A) ( 配备恒温箱的 Agilent 1290 Infinity lI样品瓶进样器(G7129B) ) ( Agilent 1290 Infini t y ll高容量柱温箱 (G7116B) ) 质谱系统 配备安捷伦喷射流离子源的 Agilent 6546LC/Q-TOF ( 方法 ) 如文中所述，使用传统的自动 MS/MS 方法或迭代 MS/MS 方法集集数据。表1和2列出了色谱与6546 Q-TOF的条件和参数。 参数 Agilent 1290 Infinity II LC 分析柱 Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18， 3.0×100 mm，2.7 pm(部件号695975-302) 保护柱 Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18， 3.0×5 mm， 2.7 pm (部件号823750-911) 柱温 50℃ 进样量 2pL(正离子模式)，5pL(负离子模式) 自动进样器温度 50°C 进样针清洗 放入清洗口15秒 (50：50甲醇/异丙醇) 流动相 A) 含10 mmol/L 乙酸铵和 0.2 mmol/L 氟化铵的9：1水/甲醇溶液 B) 含10 mmol/L 乙酸铵和 0.2 mmol/L 氟化铵的 2：3：5乙腈/甲醇/异丙醇溶液 流速 0.6 mL/min 梯度程序 时间(min) %B0.00 701.00 703.50 8610.00 8611.00 10017.00 10017.10 7019.00 70 停止时间 19 min 后运行时间 无 观察到的柱压 170-330 bar 采集方法编辑器中的迭代 MS/MS 参数设置如下： 为调用迭代 MS/MS，将采集工作列表设置如下： 右键单击，然后选择 Add Columns(添加列) 从 MS Parameter (MS参数)列类型下的可用列中选择 Iterative (迭代)(图1) 在“迭代”列中键入 Start(开始)或 Reset (重置)(图2)以指示迭代组的开始。这将重置之前的所有循环排除列表，并开始新的排除列表 键入 Iterative(迭代)或任何其他字词，指定使用并添加到排除列表中的后续迭代进样 空白单元格表示进样既不使用也不添加到排除列表，但是不重置工作列表。但是，应当注意，完整或部分(时间段)靶向 MS/MS或扫描(仅适用于 MS) 采集方法将重置循环排除列表 Inj Vol (ul) Iterative Comment As Method start As Method iterative As Method iterative As Method iterative As Method iterative As Method 图2.迭代MS/MS工作列表设置 参数 6546 LC/Q-TOF 气体温度 200C 气体流速 10 L/min 雾化器 (psig) 50 鞘气温度 300°C 鞘气流速 12L/min 毛细管电压 3500V(+)， 3000V(-) 喷嘴电压 0V 碎裂电压 150 V 锥孔电压 65V 八极杆 RF Vpp 750 V 参比质量 m/z 121.050873， m/z 1221.990637 (+) m/z 119.03632， m/z 980.016375(-) MS 和 MS/MS 范围 m/z 40-1700(+) MS 和 MS/MS 最小采集速率 3幅谱图/秒 分离峰宽 窄(约1.3m/z) 碰撞能量 20 eV (+)， 25 eV (-) 每个循环的最大母离子数 3 基于母离子丰度的扫描速度 是，目标物为25000响应值/质谱图 使用 MS/MS 累积时间限 是 易除未达到目标 TIC 的母离子 否 MS/MS 阈值 5000 响应值和 0.001% 启用主动排除 是，重复一次，然后排除0.05 min 纯度 严格性70%，截留率0% 同位素模型 常见有机分子 母离子排序 1， 2，未知 静态排除范围 m/z 40-151 (+) m/z 40-210(-) Add Columns 图1.“添加列”对话框 软件 利用Agilent MassHunter Q-TOF 数据采集软件10版操作6546 LC/Q-TOF 系统。利用 Agilent MassHunter Lipid Annotator 软件1.0版进行其他数据分析。使用默认方法参数，但是在正离子模式分析时仅考虑[M+H]*和[M+NH]*母离子，在负离子模式下分析时仅考虑[M-H]和 [M+HAc-H]母离子。利用 Agilent MassHunter PCDLManager B.08 SP1 版管理并编辑导出的标注。 利用 Lipid Annotator 软件分析血浆迭代MS/MS 数据 可靠的脂质标注需要在 MS/MS 模式下进行数据采集，，1以实现与计算机生成的数据库的子离子谱图匹配。本研究将创新的软件工具 (Lipid Annotator) 与贝叶斯评分(一种概率密度算法)和非负最小二乘拟合相结合，搜索由 Kind 等人3.4开发的理论脂质谱库(改进的 LipidBlast)!以标注MS/MS 谱图。 Lipid Annotator 不会过度标注脂质实体，而是仅提供由 MS/MS 谱图获得的可靠结构信息。 之前的研究表明， Q-TOF 迭代 MS/MS 采集模式对单克隆抗体的深入肽谱分析非常有效。我们将 6546 LC/Q-TOF 上的这种迭代采集模式应用于复杂的脂质样品。图3示出了迭代 MS/MS 的策略。对第一次进样进行传统的数据依赖型(常规) 自动MS/MS分析，在考虑主动排除列表的情况下，选择前N个丰度最高的母离子进行碎裂。在后续进样中，利用自定义的质量数误差范围和保留时间排除范围，循环排除先前进样中选择用于MS/MS 碎裂的母离子。 )循环排除的母离子 Lipid Annotator 能够将来自同一样品的多个 MS/MS 数据文件在一个批次中一起分析。图4示出了对五个血浆迭代 MS/MS 五次迭代 MS/MS 进样 PC (27.3%) 图4.正离子模式下血浆的典型总离子流色谱图(TIC)与 Lipid Annotator 软件的视图一致。所示结果为五个迭代 MS/MS数据文件的组合分析结果。将标注的脂质特征绘制为 m/z 对保留时间的图，并按照对应于饼图的脂质类别着色，标注的脂质的数量在饼图中以百分比显示 迭代MS/MS可增加脂质标注 与传统的自动 MS/MS 文件相比，多个迭代 MS/MS数据采集文件中对血浆的脂质标注累计数量有所增加(图5)。这些结果表明，使用本研究中所用的方法参数，3至5次迭代MS/MS 进样足以全面标注血浆中的脂质。虽然血浆代表一种常见的复杂生物样品，但值得注意的是，最佳进样次数可能取决于样品复杂性和 LC/MS 采集方法参数。对于正离子模式下的血浆提取物，对五次连续进样应用迭代 MS/MS时，与采用常规自动MS/MS 采集 (n=223) 的五次连续进样相比，独特标注的脂质增加了 69%(n=355)(图5A)。同样，在血浆的阴离子模式分析中，与常规 MS/MS 分析 (n=243)相比，通过五次进样的迭代 MS/MS分析所获得的脂质标注增加了34%(n=326)(图5B)。总而言之，这些结果表明，由于色谱运行中许多脂质母离子的谱图较为密集 (尤其是在阳离子模式下)，将迭代 MS/MS 用于基于 LC/MS/MS 的脂质组学数据采集具有极大的优势。 迭代 MS/MS 能富集低丰度和特定脂质 类别的脂质离子与迭代 MS/MS模式中连续排除高丰度脂质母离子一致，我们观察到正极性(图6A)和负极性(图6B)数据集中，前三次血浆进样中触发的脂质母离子的平均峰值丰度有所降低。另外，在正极性和负极性数据集中，第二次进样中所标注的脂质的峰值丰度均显著低于初始进样(t检验p值<0.001)。 由于高丰度母离子的迭代排除，我们观察到，迭代 MS/MS 富集了低丰度脂类(例如，二酰甘油)、电离效率较低的脂类(例如，游离胆固醇)，或位于色谱图的谱图密集区域的脂类(例如，三酰甘油)。表3显示了与常规自动MS/MS相比，通过连续进样迭代 MS/MS 高度富集的脂质类别的示例。 图6.对应于所标注脂质的特征丰度箱线图，这些标注的脂质来自正离子(A)和负离子(B)模式下的三次连续迭代MS/MS进样 表3.各种脂类通过迭代 MS/MS 得到高度富集。通过常规自动 MS/MS 采集五次连续进样所得到的累积标注的脂质数量与迭代 MS/MS 数据采集的比较 脂质类别(极性) 标注数量 自动 MS/MS 标注数量 迭代 MS/MS 神经酰胺非羟基脂肪酸-鞘氨醇(+) 2 10 胆固醇酯(+) 4 10 游离胆固醇(+) 0 1 二酰甘油(+) 1 7 磷脂酰乙醇胺(+) 2 14 三酰甘油(+) 46 78 连接醚的磷脂酰胆碱(-) 17 28 溶血磷脂酰肌醇(-) 5 9 磷脂酰乙醇胺(-) 9 20 图7进一步展示了脂类富集的具体示例，在连续进样中选择对应于低丰度胆固醇酯的母离子用于 MS/MS 碎裂。 考虑脂质异构体的 MS/MS 采集参数优化为确保血浆脂质的最佳覆盖范围， MS/MS采集方法参数设置至关重要。首先， LipidAnnotator 软件采用特征查找算法处理自动 MS/MS 或迭代 MS/MS 数据文件。在MS1 级执行特征查找，并将 MS/MS 谱图与后续步骤中的各个特征关联起来。所得特征表中仅包括具有相关联的 MS/MS谱图的特征。使用 Lipid Annotator 进行特征查找时，建议在色谱峰上选择至少四个MS1数据点。因此，必须优 化MS/MS采集参数(采集速率和每个循环的母离子数)，确保循环时间满足这一最低要求。对于本研究中使用的色谱方法和血浆样品，结果观察到脂质色谱基峰宽度约为6-14秒，平均峰宽约为8秒。因此，给定最小观测峰宽为6秒，对MS/MS 参数进行调整，得到1.43秒的循环时间。这样确保最窄的色谱峰中至少有四个点。 迭代 MS/MS 采集参数对于脂质组标注覆盖范围非常重要，特别是对于脂质异构体而言。在这一背景下，我们将脂质异构体定义为多种标注的脂质特征具有相同的总成分(以及相同的母离子 m/z)但保留时间不同。然而，在某些情况 下， MS/MS 谱图能够在组分水平上进一步区分异构体，例如提供有关酯化的脂肪酰基的信息(例如， PC 18：2_18：2与PC 16：0_20：4)。血浆分析将得到大量脂质异构体，355种标注脂质中的164种(正离子模式)以及326种标注脂质中的143种(负离子模式)均为脂质异构体。为确保该工作流程中不遗漏脂质异构体，必须将主动排除窗口和迭代 RT排除范围设置得足够低，以便具有相同母离子质量数的紧邻洗脱的异构体有机会触发 MS/MS分析。图8展示了一对峰宽较窄的紧邻洗脱的溶血磷脂酰胆碱 (LPC)异构体。 图7.使用来自血浆脂质提取物的迭代MS/MS 增加了胆固醇酯(CE)母离子的选择。A)富含标注的三酰甘油(TG)脂质(黑色特征)的保留时间区域的提取 MS/MS 色谱图叠加。B)在首次进样中选择四种独特的 CE 脂质母离子(蓝色特征)进行碎裂。C)剔除高丰度 CE (x符号)和TG(未示出)后，在后续进样中选择另外三种低丰度的独特 CE 母离子(绿色特征)。红色菱形表示色谱图中的 MS1 扫描， 其中选择 CE [M+NH]*母离子进行 MS/MS分析 本应用简报表明， LC/Q-TOF 数据采集的迭代 MS/MS 模式为改善复杂样品的脂质标注提供了极大的优势。将此方法应用于血浆脂质提取物时，标注的脂质总数显著增加，并且低丰度脂类通过迭代 MS/MS得以富集。 Lipid Annotator 软件能够利用迭代 MS/MS数据快速自动生成具有宽标注覆盖范围的自定义 PCDL 谱库。这些包含 RT 信息的谱库是安捷伦脂质组学软件工作流程的重要组成部分，涵盖了从脂质标注到差异分析的靶向和非靶向脂质分析。 图8.针对脂质异构体优化的迭代 MS/MS 参数。显示了用 Lipid Annotator 软件标注的两种溶血磷脂酰胆碱(LPC) 20：4 异构体的提取离子色谱图。红色菱形表示假设的 MS1 扫描，其中触发 LPC 20：4 [M+H]* 母离子 m/z544.3398 用于 MS/MS 分析。将迭代 RT 排除范围设置为±0.1分钟，确保在后续进样中挑选相邻 LPC 异构体的相同母离子 m/z (±20 ppm) 进行 MS/MS分析 1. ( Cajka， T.； Fiehn， O . LC/MS Method forComprehensive Analysis of Plasma Lipids S (用于全面分析血浆脂质的LC/MS 方法)，安捷伦科技公司应用 简报，出版号5991-9280EN， 2 018 ) 2. Sartain，M.； Sana， T. 色谱对肝脏组织提取物中脂质分析的影响，安捷伦 科技公司应用简报，出版号 5991- 5494CHCN，2015 3. Kind， T.； et al. LipidBlast in silico tandem mass spectrometry database for lipid identification. Nature Methods 2013，10(8)， 755-758 4. Tsugawa，H.； et al. MS-DIAL： data-dependent MS/MS deconvolution for comprehensive metabolome analysis. Nature Methods 2015， 12(6)， 523-526 5. Wu， L.；Wong，D. L. 采用 6545XT 的迭 代 MS/MS 采集方法进行深入的肽谱 分析，安捷伦科技公司应用简报， 出版号5991-8633ZHCN， 2017 www.agilent.com/chem 仅限研究使用。不可用于诊断目的。 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 ( @安捷伦科技(中国)有限公司，2019 ) ( 2019年3月26日，中国出版 ) 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线：800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn 基于质谱的脂质组学面临的一项主要挑战是，实现对生物样品中宽浓度范围内大量不同脂质的全面表征。虽然鸟枪法脂质组学推动了脂质分析领域的发展，但它受到一些限制，包括无法区分可能具有重要生物学意义的同质异位物质，并且由于电离抑制而导致动态范围较窄。由此催生了将高效液相色谱 (HPLC) 与高分辨率质谱(MS) 联用的基于色谱的脂质分析方法。为了与计算机生成的数据库进行子离子谱图匹配，可靠的脂质标注需要在 MS/MS 模式下进行数据采集。然而，虽然液相色谱分离有助于阐明同分异构脂质并降低复杂性，但数据依赖型高分辨率 MS/MS 数据受到色谱洗脱过程中可选择用于碎裂的母离子数量的限制。因此，在复杂样品的单次分析中无法获得所有目标 MS/MS 谱图。由于存在浓度偏差，该策略经常遗漏重要的低丰度脂质。本应用简报展示了应对这些挑战的解决方案。我们使用反相 (RP) 色谱，其非常适合分离许多同分异构脂质，并且是全面分析血浆、组织和细胞脂质的常用方法。将这种液相色谱分离技术与 Agilent 6546 LC/Q-TOF 相结合，后者是一种专门设计用于同时提供宽动态范围和高分辨率的质谱仪，并且其分辨率不受采集速度的影响。我们还评估了全自动 Q-TOF 迭代 MS/MS 采集模式，其中对样品多次进样，并循环排除之前选择用于 MS/MS 碎裂的母离子。这些结果表明，使用迭代 MS/MS 能够显著改善血浆脂质组覆盖范围。可以将迭代 MS/MS 数据用于 Agilent Lipid Annotator 软件，作为完整脂质组学工作流程的一部分。