人血清中脂溶性维生素 A 和维生素 E检测方案(液质联用仪)

作者 Mohamed Youssef、Maxcy Stroman 和Vaughn P. Miller 安捷伦科技有限公司 Wakefield. MA 使用 Agilent RapidFire 高通量质谱系统对人血清中的脂溶性维生素A和维生素E 进行超快速定量分析 应用简报 临床研究 摘要 分析血清中的维生素A和维生素E时，临床研究实验室需要可靠的分析方法和准确的检测。对分析性能和通量的需求呈稳步上升趋势，这对传统分析技术提出了更高要求。我们已开发出一种使用 SPE/MS/MS 系统分析血清中维生素A和维生素E的分析方法，与传统检测方法相比，这种方法具有更短的样品分析周期，可得到相似的分析结果。经过简单的蛋白质解离、稀释，然后使用 Agilent RapidFire 高通量质谱系统进行分析，可以精准地测定人血清中的维生素A和维生素E分析物，线性范围分别为 0.1-5 pg/mL 和 0.4-20 pg/mL。RapidFire/MS/MS 系统每15秒分析一个样品，与传统方法相比，这种方法能够提供更高的通量。 前言 维生素A((视黄醇)和维生素E(a-生育酚)是人体中储存的脂溶性维生素。采用色谱方法(如 HPLC 和最新的LC/MS/MS) 可对血清中的这些维生素(图1)进行测量。某些分析方法会使用复杂的提取仪器或冗长繁琐的提取流程，这会消耗大量的溶剂或生物液体。本应用简报的主要目的是开发高选择性、高灵敏度的快速在线SPE/MS/MS 方法，这种方法的提取流程简短，提取仅消耗少量溶剂和生物液体，且周转时间极短。我们开发出一种使用 Agilent RapidFire/MS/MS系统分析血清中维生素A和维生素E的分析方法，与传统检测方法相比，这种方法具有更短的样品分析周期，可得到相似的分析结果。 采用基于96孔板的提取系统(稀释-上样)可自动完成整个样品前处理方法，从而提高了效率和实验通量。Agilent RapidFire 高通量质谱系统是一款超快速的 SPE/MS/MS系统，可在不足15秒的分析周期内实现样品分析。利用 RapidFire/MS/MS系统，这种方法能够快速精准地测量合理线性范围内的维生素A和维生素E。 实验部分 图1.维生素A和维生素E的化学结构 Agilent RapidFire/MS/MS 系统包括如下模块： Agilent RapidFire 365、配备APCI 离子源的 Agilent 6460三重四极杆质谱仪(使用 Agilent MassHunter三重四极杆采集软件 (B.06.01)、定性分析软件(B.06.00)和定量分析软件(B.06.00)) 以及 Agilent RapidFire 采集软件。 样品分析速率为15秒/样品。在所有实验中，对维生素A和维生素E的定量和定性离子以及维生素A-D5和维生素 E-D6内标进行同时测定(表1)。Agilent MassHunter 定量分析软件可自动计算定性离子比。 仪器条件 Agilent RapidFire/MS/MS 条件 缓冲液A 5 mM甲酸铵的 LC/MS级水溶液+ 0.1%甲酸；流速1.5mL/min 缓冲液B和C 5mM 甲酸铵的 LC/MS级甲醇溶液+ 0.1%甲酸；流速1.25和0.7 mL/min 水溶液清洗 HPLC级水 有机溶液清洗 100%甲醇或乙青 SPE柱 Agilent RapidFire E类柱(反相C18化学键合相， G9203-80105) RF 状态 1 600 ms RF 状态2 2500 ms RF状态3 0 ms RF状态4 8000 ms RF状态5 1000 ms Agilent 6460 三重四极杆条件 离子源 APCI 干燥气温度 325°C 气化室温度 350°C 干燥气流量 10 L/min 雾化器压力 40 psi 毛细管电压 4500V 电晕电流 表 1.MRM 离子对 化合物 01 03 驻留时间 碎裂电压 CE CAV 维生素E-D6 437.5 171.1 20 114 21 2 维生素E(a-生育酚) 431.4 165.2 20 146 25 2 维生素E(a-生育酚) 431.4 137.2 20 146 49 2 维生素A-D5 291.3 162.2 20 142 5 2 维生素A(视黄醇) 269.4 105.1 20 114 33 2 维生素A(视黄醇) 269.4 93 20 114 21 2 化学品与试剂 维生素 A 购自 Sigma-Aldrich；视黄醇-D5购自圣克鲁斯生物技术公司。维生素 E 购自 Cerilliant， Round Rock，TX。维生素E-D6购自 Toronto ResearchChemicals。质量控制和空白合成血清购自 UTAK Laboratories， Valencia， CA。所有其他溶剂和试剂均购自 Sigma-Aldrich。 样品前处理 采用以下步骤配制样品、校准品(0.1、 0.25、1.25、2.5和5.0 ug/mL 的维生素A， 0.4、1.0、5.0、10.0和20.0 pg/mL 的维生素E) 和 QC标样(0.6和1.8pg/mL的维生素A， 6.0 和 28.0 pg/mL 的维生素E)。在 2.2 mL 的深孔收集盘中，加入200pL样品、5点校准品、维生素A和维生素E的2点QC标样以及25pL内标混合液(分别含2.0 ug/mL 维生素 A-D5 和 5.0 pg/mL 维生素 E-D6的LC/MS级甲醇溶液)进行混合，再加入10pL 冰醋酸(1：1)。加入 500pL乙腈并在 3500 rpm 的转速下离心10分钟，对蛋白质进行解离。然后，将55pL样品上清液转移到黑色96孔板中的每个对应孔中。用 LC/MS级水稀释(1：10)后，用Agilent PlateLoc 孔板热封膜机将板密封，轻轻振摇混合后进行 RapidFire/MS/MS分析。 建议在合成血清中添加 EDTA 和 BHT(抗氧化剂)，以提高维生素A的稳定性和结合特性。另外，由于维生素A对光敏感，建议用黑色或不透明板进行分析。 数据分析 使用 MassHunter 三重四极杆定量分析软件进行数据分析。在多重反应监测(MRM)模式下使用线性最小二乘回归建立校准曲线，其中加权因子为1/X。利用色谱峰面积与已知浓度内标的峰面积之比进行定量分析。 结果与讨论 将维生素A、维生素E 和内标加入合成血清中，之后进行蛋白质解离，再用水将上清液稀释10倍，即制得样品。使用RapidFire/MS/MS系统和疏水性 C18柱对样品进行 SPE/MS/MS分析，速率为15秒/样品(图2)。这一 RapidFire/MS/MS 方法的通量超过240个样品/小时，提供高通量和高效的分析模式。 图2.每个分析物的典型校准曲线数据，显示进样间隔为15秒。进样最高浓度样品后再进样基质空白，未发现明显的交叉污染 血清中的维生素A和维生素E分别在0.1-5 pg/mL 和 0.4-20 pg/mL的测量范围内呈现出色的线性关系，R²值均高于0.995(图3)。通过 QC标样获得日内和日间准确度和精密度数据。日内和日间准确度的测定结果在10%以内，且测量范围内的浓度变异系数均小于10%((表2)。通过分析基质空白的AUC(分别计算与维生素A和维生素E 0.1和 0.4 pg/mL样品的平均峰面积百分比)评估交叉污染程度。所有分析物均未观察到明显的交叉污染(图2)。 图3.典型校准曲线，显示维生素A和维生素E的线性范围分别为 0.1-5 pg/mL 和 0.4-20 pg/mL。黑色圆圈代表校准品，蓝色三角形代表 QC样品 表2.QC标样的日内和日间准确度与精密度数据 维生素A浓度 日内准确度% 日内精密度% 日间准确度% 日间精密度% (ug/mL) (n=6) (n=6) (n=6) (n=6) 0.6 98.6 7.2 104.6 9.2 1.8 95.4 7.9 107.7 4.4 维生素E浓度 日内准确度% 日内精密度% 日间准确度% 日间精密度% (ug/mL) (n=6) (n=6) (n=6) (n=6) 6.0 97.5 102.1 28 102.6 102.5 对空白人血清中加入的两种分析物连续进样2000次以上，所得测定结果用于评估分析方法的重现性。两种分析物的仪器响应稳定，变异系数分别为9.0%和8.0%，表明了 RapidFire 系统的稳定性、SPE 柱的长寿命，以及样品组中分析物定量分析的一致性。例如，图4中显示了维生素E 的数据，变异系数为8.0%。 结论 使用简单的蛋白质解离和 AgilentRapidFire/MS/MS 系统稀释方法，能够快速精准地测定人血清中的脂溶性维生素A和维生素E。样品分析的进样间周期仅为15秒，这为分析物提供了高通量的分析方法。这种方法能够达到240样品/小时的通量，产生的结果与 LC/MS/MS相当，而速度和效率则可达到LC/MS/MS 的10倍以上。 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 仅限研究使用。不可用于诊断目的。 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 ◎安捷伦科技(中国)有限公司， 2014 2014年11月7日， 中国出版5991-5293CHCN Agilent Technologies     摘要    分析血清中的维生素 A 和维生素 E 时，临床研究实验室需要可靠的分析方法和准确的检测。对分析性能和通量的需求呈稳步上升趋势，这对传统分析技术提出了更高要求。我们已开发出一种使用 SPE/MS/MS 系统分析血清中维生素 A 和维生素 E 的分析方法，与传统检测方法相比，这种方法具有更短的样品分析周期，可得到相似的分析结果。经过简单的蛋白质解离、稀释，然后使用 Agilent RapidFire 高通量质谱系统进行分析，可以精准地测定人血清中的维生素 A 和维生素 E 分析物，线性范围分别为 0.1-5 g/mL 和 0.4-20 g/mL。RapidFire/MS/MS 系统每 15 秒分析一个样品，与传统方法相比，这种方法能够提供更高的通量。    前言    维生素 A（视黄醇）和维生素 E（-生育酚）是人体中储存的脂溶性维生素。采用色谱方法（如 HPLC 和最新的 LC/MS/MS）可对血清中的这些维生素（图 1）进行测量。某些分析方法会使用复杂的提取仪器或冗长繁琐的提取流程，这会消耗大量的溶剂或生物液体。本应用简报的主要目的是开发高选择性、高灵敏度的快速在线SPE/MS/MS 方法，这种方法的提取流程简短，提取仅消耗少量溶剂和生物液体，且周转时间极短。我们开发出一种使用 Agilent RapidFire/MS/MS 系统分析血清中维生素 A 和维生素 E 的分析方法，与传统检测方法相比，这种方法具有更短的样品分析周期，可得到相似的分析结果。    采用基于 96 孔板的提取系统（稀释-上样）可自动完成整个样品前处理方法，从而提高了效率和实验通量。Agilent RapidFire 高通量质谱系统是一款超快速的 SPE/MS/MS 系统，可在不足 15 秒的分析周期内实现样品分析。利用 RapidFire/MS/MS 系统，这种方法能够快速精准地测量合理线性范围内的维生素 A 和维生素 E。    结论    使用简单的蛋白质解离和 A g i l e n tRapidFire/MS/MS 系统稀释方法，能够快速精准地测定人血清中的脂溶性维生素 A 和维生素 E。样品分析的进样间周期仅为 15 秒，这为分析物提供了高通量的分析方法。这种方法能够达到 240 样品/小时的通量，产生的结果与 LC/MS/MS 相当，而速度和效率则可达到 LC/MS/MS 的 10 倍以上。