血清中睾酮检测方案(液质联用仪)

使用液质联用方法定量分析血清中的睾酮 应用简报 临床研究 摘要 目前需要通过一种超高灵敏度的定量分析方法来测定男性体内总睾酮和游离睾酮的浓度，尤其要能够测定女性和儿童体内的低浓度睾酮。因此，安捷伦开发了一种使用 Agilent 6495 离子漏斗质谱仪定量分析和表征血清中睾酮的分析方法，同时确定了最适合实验室使用的分析方法。 作者 Vasanta Putluri'、Sriramya Donepudi'、Feng Jin、Andre Szczesniewski、Vadiraj Bhat、Peter J Cook、Dolores J. Lamb、Arun Sreekumar和 Putluri Nagireddy Dan L. Duncan 癌症中心， 分子和细胞生物学系， 贝勒医学院分子研发 Alkek 中心， Houston， TX，USA 安捷伦科技有限公司 Wood Dale， IL 前言 睾酮 (T) 是一种促进男性生殖器发育的雄性激素，与女性的雌性激素前体类似，它可以影响男性的第二性征。它可以发挥同化作用，并对两性行为产生影响。循环睾酮可与性激素结合球蛋白(SHBG)结合，其中小部分与白蛋白结合，另一小部分以游离激素形式存在。非 SHBG 结合的游离睾酮是生物活性成分，因为与血清白蛋白结合的睾酮可以自由离解。 实验部分 化学品与试剂 用于基质匹配校准物的人血清购自Golden West Biologicals (Temecula， CA)。标样和内标购自 Sigma-Aldrich (St Louis，MO)。样品前处理和液相色谱溶剂购自 Burdick & Jackson (Morristown， NJ)。 样品前处理 根据以下步骤配置梓品、校准物和基质中的质量控制(QC)物质。 1. 将 100pL样品和5pL5ng/mL 内标置于试管中 2. 向每个试管中加入2 mL HPLC 级的3：2乙酸乙酯/己烷，并涡旋混合2分钟 3. 将有机层转移至另一洁净试管，并加入 500 pL 0.1 mol/L NaOH 溶液 4. 在室温下收集有机层并在氮气下吹干 5. 干燥后，将样品复溶于 100 pL 70：30的水/甲醇中进行分析 数据分析 采用 Agilent MassHunter 采集软件(B.07)进行系统控制和数据采集。采用 Agilent MassHunter 定量分析软件(B.07)对数据进行分析。 液相色谱配置和参数 配置 Agilent 1290 Infinity lI 高速泵 (G7120A) Agilent 1290 Infinity IIMultisampler (G7167B) Agilent 1290 Infinity II高容量柱温箱(G7116B) 分析柱 Agilent Poroshell 120 EC-C18， 2.1×100 mm， 2.7 mm(部件号695775-902) 柱温 50°C 进样量 10pL 流动相A 0.1%甲酸的水溶液 流动相B 0.1%甲酸的甲醇溶液 流速 0.3 mL/min 梯度 时间 (min) %B 0.0 40 5.0 70 5.1 98 7.0 98 7.1 40 MS/MS配置和参数 采用安捷伦喷射流技术的 Agilent 6495 三重四极杆LC/MS 系统 MS/MS模式 MRM 电离模式 正离子 干燥气温度 260°C 干燥气流速 11 L/min 雾化器压力 30 psi 鞘气温度 400°C 鞘气流速 12 L/min 毛细管电压 4000V EMV 500 V 喷嘴电压 2000V 01/Q2分辨率 0.7/0.7 Unit 驻留时间 80 ms 碎裂电压 380 V 碰撞池加速器电压 3 离子漏斗低压 RF 100 离子漏斗高压 RF 110 化合物 母离子 定量离子 定性离子 碰撞能量(V) RT (min) 睾酮 289.2 109 97 28/24 2.455 睾酮c. 292.2 112 100 28/20 2.453 结果与讨论 线性 采用线性回归拟合和1/x的加权因子得到了不包括原点在内的校准曲线，从而确定了总睾酮在 1-1000 pg/mL 浓度范围内的相关系数(R’)平均值大于 0.998(图1)。根据 10：1 的信噪比(S/N) 测定得到定量限 (LOQ)为 5 pg/mL。 准确度和精度 本研究得出了出色的结果，结果汇总如表1所示。在4天的单次运行中，对六种浓度的 QC样品进行五次分析。表1显示了每日的准确度和整体精密度。所有QC样品的准确度为75%-125%，精密度<13%。 将 LC/MS/MS分析方法与经过预先验证的 ELISA 方法相比，以确保结果的准确性。采用 LC/MS/MS 分析方法和 ELISA 方法提取并分析二十五份机密的患者样品。表2列出了通过这两种方法得到的结果 (ng/dL)和百分比差异。如图2所示，R'>0.96。 第1天 第2天 第3天 第4天 预期浓度 计算浓度 (pg/mL) 准确度 计算浓度 (pg/mL) 准确度 计算浓度 (pg/mL) 准确度 计算浓度 (pg/mL) 准确度 精密度(%) 25 31.3 125.2 27 108.1 26.5 106.1 25.7 102.9 9 50 46.7 93.4 42.6 85.2 39.3 78.6 45.5 91.1 7.6 100 74.6 74.6 93 93 75 75 94 94 12.8 250 232 92.8 229.9 92 202.8 81.1 223.3 89.3 6 500 442 88.4 479.7 95.9 593.9 118.8 498.6 99.7 12.9 1000 1036 103.6 1015 101.5 986.1 98.6 1008 100.8 2 表2.采用LC/MS/MS 和 ELISA 方法测得的血清样品中睾酮的相关性 血清 LC/MS/MS Elisa 值 样品 浓度 (ng/dL) (ng/dL) %差异 1 712.5366 689 103% 2 688.1343 697 99% 3 158.2041 165 96% 4 107.0431 122 88% 5 995.1148 1024 97% 6 1734.5629 1582 110% 7 560.4065 572 98% 8 130.7686 147 89% 9 63.4752 81 78% 10 1484.4782 1228 121% 11 71.49831763 73 98% 12 722.5537 768 94% 13 124.6216 136 92% 仪器对比 使用两台 Agilent 6495三重四极杆LC/MS仪器分析相同样品并对比结果。如图3所示， R²值>0.96. 结论 这些数据表明，该提取流程和 LC/MS/MS分析方法可用于对低浓度总睾酮进行所需的定量分析。所购买基质材料中的低浓度睾酮和其他干扰化合物成为了限制因素，阻碍了该分析方法检测低浓度的睾酮。校准曲线获得了出色的线性，并得到了高度重现、准确而精确的数据。 ( 参考文献 ) 1. Analysis of testosterone anddihydrotestosterone in mouse tissuesby liquid chromatography-electro-spraytandem. Annal Biochem. 2010， 15，402(2)， 121-128 2. Derivatization reagents in liquidchromatography/electro-sprayionization tandem mass spectrometryfor biomedical analysis. Drug Discov.Ther. 2007， 1(2)， 108-118 图2.采用 LC/MS/MS 和 ELISA 方法测得的血清样品中睾酮的相关性 图3.两台Agilent 6495 LC/MS/MS 测得的睾酮的相关性 摘要目前需要通过一种超高灵敏度的定量分析方法来测定男性体内总睾酮和游离睾酮的浓度，尤其要能够测定女性和儿童体内的低浓度睾酮。因此，安捷伦开发了一种使用 Agilent 6495 离子漏斗质谱仪定量分析和表征血清中睾酮的分析方法，同时确定了最适合实验室使用的分析方法。前言睾酮 (T) 是一种促进男性生殖器发育的雄性激素，与女性的雌性激素前体类似，它可以影响男性的第二性征。它可以发挥同化作用，并对两性行为产生影响。循环睾酮可与性激素结合球蛋白 (SHBG) 结合，其中小部分与白蛋白结合，另一小部分以游离激素形式存在。非 SHBG 结合的游离睾酮是生物活性成分，因为与血清白蛋白结合的睾酮可以自由离解。结论这些数据表明，该提取流程和 LC/MS/MS 分析方法可用于对低浓度总睾酮进行所需的定量分析。所购买基质材料中的低浓度睾酮和其他干扰化合物成为了限制因素，阻碍了该分析方法检测低浓度的睾酮。校准曲线获得了出色的线性，并得到了高度重现、准确而精确的数据。