牛血清白蛋白中单克隆抗体检测方案(液质联用仪)

利用 LC/Q-TOF 进行亚 ng级完整单克隆抗体定量分析 应用简报 作者 前言 Alex Zhu、David Wong 和 Aaron Boice 研究人员通常利用针对酶解样品的特征肽的靶向多反应监测 (MRM)技术对生物药物进行定量分析。尽管这项技术具有极高的分析灵敏度，但是它存在两个明显的局限性：无法检测非预期分子形态以及样品处理过程中可能引入假象。在完整蛋白质水平上进行定量分析可克服这些限制，但却要分别面临分析灵敏度和重现性的挑战。本研究使用色谱技术的最新进展和高性能 Agilent 6545XTAdvanceBio LC/Q-TOF 建立了一种线性动态范围极宽的高灵敏度、高重现性定量分析方法。 图1. Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF 系统 实验部分 试剂与化学品 曲妥单抗单克隆抗体(mAb)制剂标准品购自基因泰克(So. San Francisco，California， USA)。牛血清白蛋白 (BSA)和甲酸(FA) 购自 Sigma-Aldrich。 样品前处理 用含有0.01% BSA (w/v) 和 0.1% FA 的去离子水稀释浓度为24 pg/pL 的糖基化曲妥单抗储备溶液，以覆盖 0.01 ng/pl至100 ng/pL的浓度范围。稀释比为恒定的1：3.162(10的平方根)，每个稀释浓度对应于动态范围的半个数量级。 仪器与软件 采用 Agilent 1290 Infinity II UHPLC 系统进行分离，该系统包括： Agilent 1290 Infinity Ⅱ二元泵(G4220B) Agilent 1290 Infinity II Multisampler(G7167B) Agilent 1290 Infinity lI 柱温箱(G7116B) 该 UHPLC 系统与配备安捷伦双喷射流 电喷雾离子源的 Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF 系统结合使用。利用具有大分子SWARM 自动调谐功能的 Agilent MassHunter 采集 (B.08.01)工作站软件采集数据。使用AgilentMassHunter BioConfirm (B.08.00) 和 AgilentMassHunter 定量分析软件 (B.08.00) 进行数据分析。 方法 表 1总结了 Agilent 1290 Infinity II UHPLC条件。所用的梯度方法中包括0.9分钟的停流时间。表2总结了质谱仪条件。 SWARM 自动调谐用于优化大分子传输和检测。 表 1. Agilent 1290 Infinity II UHPLC 条件 液相色谱条件 色谱柱 Agilent ZORBAX RRHD 300-Diphenyl 1.8 pm， 2.1×50 mm， 857750-944 柱温 80°C 进样量 1pL Multisampler 温度 4℃ 多重清洗 90/10ACN/H，0 30 s， 然后在起始条件下保持10s 流动相 A)H，0， 0.1%甲酸 B) 90/10乙腈/H，0，0.1%甲酸 流速 0.500 mL/min 梯度 0.0 min 34.6%B 0.1-1.0 min 停流 0.9分钟 2.0 min 34.6% B 3 min 90%B 停止时间 4 min 后运行时间 1.5 min 分析周期 约6.5 min (包括进样时间) 表 2. Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF 方法参数 参数 值 电离模式 AJS， 正离子 干燥气温度 290°C 干燥气流速 13 L/min 雾化器压力 45 psi 鞘气温度 380°C 鞘气流速 12 L/min 毛细管电压 5500V 喷嘴电压 2000 V 碎裂电压 380V 质量范围 600-5000 CE 四极杆AMU 350 采集速率 2幅谱图/秒 分析灵敏度 该方法能够检测柱上进样量低至0.0316 ng 的完整 mAb。总共对三个电荷态下强度最高的12个糖型峰生成了提取离子色谱图 (EIC)， 每个峰的提取窗口为±2m/z。图1显示了每个稀释浓度下六次重复进样的叠加提取结果以及每个浓度下的解卷积质谱图，证明质谱结果一致。6545XT AdvanceBioLC/Q-TOF 优异的完整蛋白质灵敏度归功于光学元件、真空和加热器系统的多种优异设计特性，这些特性与SWARM 自动调谐功能结合后可充分发挥作用，以实现针对大分子分析的性能优化。此实验还使用了本文未示出的 Agilent 6550 iFunnel Q-TOF液质联用系统，该系统采用六孔毛细管设计以最大程度提高离子采样效率。6545XT使用单孔毛细管设计，与6550系统相比仍能获得高出4倍的灵敏度。 148544.58 147911.58 10 ng 148220.64 148059.57 148382.11 148543.22 147912.85 11 148059.52 148381.80 148542.68 147852.26 31.6 ng 50 ng 图1.所有稀释水平下色谱响应的重现性 重现性 通过以 10 ng 柱上进样量进样100多次来评估峰响应的重现性。图2绘制了实验过程中获得的 EIC 峰面积。记录的峰面积表明，即使对于这一较低的柱上进样量，精密度也可达到 1.5%RSD。本实验进行时未采用内标进行响应校正，这体现了1290 Infinity II UHPLC 以及LC/Q-TOF 检测的稳定性。 质量准确度 为了确认鉴定结果，在BioConfirm 中使用最大熵算法进行谱图解卷积。采用10ng 的进样量重复测定100次，以确定用于中性电荷质量分配质量准确度的重现性。图3显示了对两个强度最高的糖型进样100 次过程中记录的质量误差。每个数据点均处于10 ppm质量误差以内，两个强度最高糖型的平均误差分别为-1.78 ppm 和-5.68 ppm。同样值得注意的是，这些误差的标准偏差均低于2.0 ppm。这一较低的变异性水平为大规模实验奠定了基础。 线性动态范围 本实验的最后一部分用于确定该方法能够实现的线性动态范围，结果显示了 3.2个数量级的线性响应。据报道，利用LC/MS 进行完整蛋白质分析的线性响应比传统小分子分析的线性响应存在更多的限制。采用该方法获得的线性响应涵盖0.0316 ng 至最高50 ng的柱上进样量范围。这表示线性动态范围达3.2个数量级，优于目前已公布的所有方法的线性动态范围。图4显示了 MassHunter定量分析软件中生成的校准曲线以及在各个浓度水平下重复进样得到的统计结果。 图2.100次进样中强度最高的两种糖型的质量准确度测量结果直方图 图3.以10 ng 的柱上进样量进样100次获得的强度重现性 图4.显示完整糖基化 mAb 分析的线性响应达3.2个数量级的校准曲线 结论 ( 该方法具有优异的分析灵敏度、重现性和准确度，能够满足完整糖基化单克隆抗体可靠定量分析的需要。通 过SWARM 自动调谐对 Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF 的大分子分析进 行自动优化后，该系统与 Agilent 6550 iFunnel Q-TOF 液质联用系统相比检测限 和动态范围都获得了大幅提高。其重 现性还可归因于 Agilent 1290 Infinity ⅡI UHPLC 系统达到的卓越性能水平。进样的数百个样品和精确的结果为完整mAb 及其他大分子的大规模定量分析 奠定了基础。 ) ( 1. van d en Broek， I.； van Dongen， W. D.LC-MS-based qu a ntification of intact proteins： perspective for clinical and b ioanalytical applications. Bioanalysis 2015， 7.15，1943-1958 ) 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 仅限研究使用。不可用于诊断目的。 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 ◎安捷伦科技(中国)有限公司，2017 2017年2月24日， 中国出版 5991-7814CHCN Agilent Technologies Agilent Technologies 前言研究人员通常利用针对酶解样品的特征肽的靶向多反应监测 (MRM) 技术对生物药物进行定量分析。尽管这项技术具有极高的分析灵敏度，但是它存在两个明显的局限性：无法检测非预期分子形态以及样品处理过程中可能引入假象。在完整蛋白质水平上进行定量分析可克服这些限制，但却要分别面临分析灵敏度和重现性的挑战。本研究使用色谱技术的最新进展和高性能 Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF 建立了一种线性动态范围极宽的高灵敏度、高重现性定量分析方法。结论该方法具有优异的分析灵敏度、重现性和准确度，能够满足完整糖基化单克隆抗体可靠定量分析的需要。通过 SWARM 自动调谐对 Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF 的大分子分析进行自动优化后，该系统与 Agilent 6550 iFunnel Q-TOF 液质联用系统相比检测限和动态范围都获得了大幅提高。其重现性还可归因于 Agilent 1290 Infinity II UHPLC 系统达到的卓越性能水平。进样的数百个样品和精确的结果为完整 mAb 及其他大分子的大规模定量分析奠定了基础。