聚乙二醇粒细胞集落刺激因子 (PEG GCSF)中分离和定量分析检测方案(液相色谱仪)

使用 Agilent AdvanceBio SEC 色谱柱分析聚乙二醇化蛋白质 应用简报生物制药 作者 摘要 M.Sundaram Palaniswamy安捷伦科技有限公司 印度 通过聚乙二醇化能够改变治疗性蛋白质的物理化学和生物性质(如提高溶解度、降低免疫原性、延长半衰期以及防止蛋白酶破坏)，从而显著提高其价值。体积排阻色谱法(SEC) 是检测分子量大于聚乙二醇化蛋白质杂质的首选方法。由于聚乙二醇介导的与硅胶固定相的相互作用会导致回收率降低、峰形变差以及过度拖尾，因此聚乙二醇化蛋白质的 SEC 分析面临着很大挑战。本应用简报描述了一种用于检测聚乙二醇粒细胞集落刺激因子 (PEG GCSF) 的简单而灵敏的 SEC 方法。采用 AdvanceBio SEC， 130A，7.8×300 mm， 2.7 um 色谱柱在水相流动相下进行 PEG GCSF 的分离和定量分析。线性曲线在12.5-2000 pg/mL 的范围内具有优异的相关系数，表明该方法适用于定量分析。该方法具有出色的保留时间和峰面积精度，证明了该方法的适用性。此外，AdvanceBioSEC 还可对强制应激研究中得到的聚集体进行分离与定量分析。 聚乙二醇化是聚乙二醇(PEG) 聚合物链与另一个分子发生共价结合的过程，另一个分子通常是药物或治疗性蛋白质。将PEG 的活性衍生物与目标大分子共同温育通常可实现聚乙二醇化。PEG 基团具备的多项优势有助于提高蛋白质稳定性并延长体内的循环半衰期。美国食品药品监督管理局 (FDA) 已批准 PEG 为公认安全物质[1]。目前已有集中聚乙二醇化产品通过了 FDA 的审批。聚乙二醇粒细胞集落刺激因子 (PEG GCSF) 是一种长效的重组 GCSF，其中含有 GCSF 以及 20 KDa 与甲硫氨酸残基N端共价结合的聚乙二醇分子。 GCSF 是一个含有175个氨基酸的蛋白质，分子量为18800道尔顿。 PEG GCSF 的总分子量为 39 KDa。各论草案方法推荐使用体积排阻色谱 (SEC) HPLC 测定 PEG GCSF 和更高分子量聚集体的纯度[2]。多数针对 PEG GCSF 的已发布方法采用含有100 mM NaCl、85%磷酸以及最多 10%乙醇的水相流动相以减少非特异性相互作用并改善峰形和分离性能[3]。聚集体有时会比自然形态更易于与固定相结合，因此治疗性蛋白质的不理想吸附是 SEC 分析过程中的一个主要问题。由于这一优先结合趋势，聚集体的 SEC 分析往往并不准确，甚至存在无法检出的风险。使用含有机溶剂或极端pH的流动相可解决这一问题，结果表明这种流动相能够提高分离度和回收率。然而，除可能会使可逆聚集体解离外，这种流动相还可能会使配方缓冲液中不可逆的聚集体发生解离[4]。 本文展示了用于 SEC 分析的突破性技术 Agilent AdvanceBioSEC， 130A， 7.8×300 mm， 2.7 pm 色谱柱的优势。这款色谱柱采用创新型硅胶填料和特有的亲水键合技术，可使各种样品均获得出色的分离度和体积分离，且无需向流动相中添加有机改性剂。 材料与方法 仪器 ( 采用完全生物兼容且最大系统耐压为600 bar 的 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统，由以下几个模块组成： ) ( ·A Agilent 1260 In f inity 生物惰性四元液谱色谱泵(部件号 G5611A) ) ( Agilent 1260 Infinity 生物惰性高性能自动进样器(部件牛 G5667A) ) ( Agilent 1200 Infinity 系列恒温器(部件号 G1330B) ) ( 包含生物惰性溶剂加热元件的 Agilent 1260 Infinity 柱温箱 (部件号 G1316C， 选项19) ) ( Agilent 1260 Infinity DAD VL (部件号 G131 5 D， 配备生物惰 性标准流通池，10mm) ) ( 填充 2 . 7 pm 填料的 Agilent AdvanceBio SEC， 130A， 7.8 × 300mm (部件号 PL1180-5350) ) 软件 ( Agilent ChemStation B.0 4 .03(或更高版本) ) SEC 参数 表1列出了使用 Agilent 1260 生物惰性液相系统进行 SEC分析的色谱参数。 表 1. SEC HPLC 的色谱参数 参数 条件 150mM磷酸钠缓冲液， pH 6.8 流动相：TCC温度： 室温等度运行： 流动相A进样量： 10uL流速： 0.8 mL/min紫外检测： 214 和280 nm 试剂、样品与材料 商品化 PEG GCSF 购自当地药房并遵照制造商的使用说明进行储存。磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和盐酸均购自 Sigma-Aldrich。使用的所有化学品和试剂均为 HPLC级。高纯水来自 Milli Q 水纯化系统 (Millipore Elix 10型，美国)。 步骤 进样10pL流动相A作为空白，随后对各线性浓度分别重复进样三次。用每个浓度的峰面积和保留时间 (RT)计算标准偏差(SD)和相对标准偏差 (RSD%)值。以较低线性浓度样品的进样分析确定检测限(LOD)和定量限(LOQ)。将各线性浓度下的平均峰面积对分析物浓度作图，得出单体校准曲线。 线性和范围 校准曲线由浓度范围为 7.8-2000 ug/mL 的9个 PEG GCSF 的标准浓度点构建。 LOQ 和 LOD 将信噪比 (S/N)>3 时的最低 PEG GCSF 浓度定义为LOD， 而将S/N > 10 时的浓度定义为 LOO. PEG GCSF 聚集体制备 根据各论草案制备 PEG GCSF 聚集体。简言之，将约2 mg/mL的药品置于聚丙烯管中并分别在55°℃下温育60、120和180分钟。随后将样品冷却至室温并立即进行分析。 系统适用性 根据各论草案的规定，聚集体的比例不得超过5%。此外，3次重复进样之间聚集体峰面积比的 RSD% 不得高于10%。3次重复进样中 PEG GCSF 单体峰的 RT 差异不得超过0.2分钟。 结果与讨论 分离和检测 图1表明在该色谱条件下完整 PEG GCSF 可实现良好分离，表现为5.989分钟的单个对称峰。图中可明显看到共轭物包括二聚体和更高分子量的聚集体，如放大视图所示。然而，由图中不存在晚洗脱峰可以看出出品中不含游离GCSF。 保留时间和峰面积的精密度 该流程的精密度以一系列测定结果间的接近一致程度来表示。可通过在前述条件下对均匀样品进行多次分析得到这些测定结果，常用相对标准偏差 (RSD) 表示。图2展示了六次重复进样的叠加色谱图，表明结果具有绝佳的分离重现性。表2列出了六次重复进样中 PEG GCSF 单体和聚集体的平均 RT 和峰面积 RSD。主峰的保留时间和峰面积的 RSD 分别为 0.023%和0.081%，表明分析方法重现性和系统精密度均十分出色。 图2.在Agilent AdvanceBio SEC， 130A， 7.8×300 mm， 2.7 pm色谱柱上分离得到的 PEG GCSF的6次重复叠加色谱图 表2.保留时间和峰面积精度(n=6) 保留时间 峰面积 样品 平均值 (min)1)RSD 平均值(mAU/min) RSD PEG GCSF 5.987 0.023 99.39 0.081 PEG GCSF 聚集体1 5.594 0.01 0.413 4.91 PEG GCSF 聚集体 2 5.340 0 0.155 5.1 这一精密度还符合了系统适用性要求： 聚集体比例不得超过5% 3次重复进样间聚集体峰面积比的 RSD% 不得超过 10% ·33次重复进样中 PEG GCSF 单体峰的保留时间不得超过0.2分钟 因此， PEG 偶合物中高分子量聚集体的含量不得超过 0.6%。此外， 由 SEC HPLC 测得的 PEG GCSF纯度应大于99%。 LOD 和 LOQ LOD 和 LOQ分别为 3.125 pg/mL 和 12.5 ug/mL， 表明该方法具有较高灵敏度。表3中列出了 PEG GCSF 的 LOD 和 LOQ测定值。图3展示了偶合物与空白的 LOD 和 LOQ叠加色谱图。 表3. LOD、LOQ和S/N的结果(n=3) 图3.在 Agilent AdvanceBio SEC， 130A， 7.8×300 mm，2.7 pm色谱柱上分离得到的 PEG GCSF 的 LOD 和 LOQ与空白的叠加色谱图 线性 聚集/降解分析与定量 使用面积响应与 PEG GCSF 浓度构建了从 LOQ 浓度到本研究中最高浓度的 PEG GCSF线性曲线。图4显示了浓度范围为12.5-2000 pg 的 PEG GCSF 线性曲线。 图5显示的经加热处理 PEG GCSF 的 SEC 图谱表明 AdvanceBioSEC 色谱柱可用于分离和检测聚集体。如色谱图所示，完整PEGGCSF 与更高分子量的聚集体彼此实现了良好分离。表4根据峰面积比总结了 PEG GCSF单体和聚集体的相对含量。 图5.采用Agilent AdvanceBio SEC 色谱柱通过 SEC HPLC 测定出的 PEG GCSF 聚集趋势。(A) 完整 PEG GCSF 对照， (B) 55C下温育60分钟， (C) 55℃ 下温育 120分钟， (D)55C下温育180分钟 数据清晰表明，聚集体在55°℃下处理后浓度有所升高，单体形式的含量则相对有所降低，由96%分别降低至70%和6.44%。 图4.12.5-2000 pg/mL PEG GCSF 8 个标准浓度的线性曲线(A)，显示出极佳的线性相关系数值。图中还显示了线性范围的叠加色谱图(B) 表4.根据峰面积得到的单体与聚集体的相对含量 时间 峰面积% 时间 峰面积% 时间 峰面积% 5.59 2.85 5.24 16.01 5.12 91.89 5.99(单体) 96 5.59 12.74 5.57 1.14 5.99(单体) 70.29 5.98(单体) 6.44 本应用简报证明了采用 PEG GCSF 作为模型蛋白质进行聚乙二醇化蛋白质分析的几个出色的解决方案。文中开发出了一种采用Agilent AdvanceBio SEC 色谱柱，无需在流动相中添加有机改性剂即可监测 PEG GCSF 纯度的简单 SEC HPLC 方法。该方法具有优异的RT 和峰面积 RSD， 并能满足 PEG GCSF 系统适用性要求。PEG GCSF 的 LOD 和 LOQ 分别为 3.125 g/mL 和 12.5 pg/mL，表明该分析方法具有较高灵敏度。12.5-2000 pg/mL的8个标准偶合物浓度的线性曲线具有极佳的线性相关系数值，表明该方法可实现准确定量分析。此外，治疗性 PEG 蛋白质的应激研究还表明 AdvanceBio SEC 色谱柱可对聚集体进行分离和检测，并能根据峰面积比进行定量分析。将这一简单的重现方法与仪器的生物惰性和耐腐蚀相结合，可使这类解决方案成为生物制药研究中聚乙二醇化蛋白质 QC分析的可靠适用方法。 查找当地的安捷伦客户中心：www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China 800@agilent.com 在线询价： ( 1. Gaberc-Porekar，V.；Zore，l.； Podobnik， B .； Menart， V. Obstacles and pitfalls i n the PEGylation of t herapeutic proteins. Current Opinion in Drug Discovery and Development 2008， 11，242-250. ) ( 2. ipc.nic.in/writereaddata/monoprepimages/Pefilgrastim-2961377726.pdf ) ( 3. R F atto， J . J.；0’C o n ner， S. R.； Distler， A. R.； Wu， G. M.；Hummel， D. ； Treuheit M. J.； H e rman， A. C.； Davis， J. M . Ethanol-sodium chloride-phosphate mobile phase f o r size-exclusion chromatography of poly (ethylene glycol) modified p roteins. J. of Chromatog. A 1997， 763，337-344. ) ( 4. Tsutomu Arakawa； et al. The Critical R ole of Mobile Phase Composition i n Size Exclusion Chromatography of Pro t ein Pharmaceuticals.J. of Pharm. Sci. 2010，99，1 6 74-1692. ) 更多信息 这些数据仅代表典型的结果。有关我们的产品与服务的详细信息，请访问我们的网站 www.agilent.com。 www.agilent.com 仅限研究使用。不可用于诊断目的。 ( 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 ) ( ◎安捷伦科技(中国)有限公司，2016 ) ( 2016年3月23日， 中国出版 ) 5991-6791CHCN Agilent Technologies 摘要通过聚乙二醇化能够改变治疗性蛋白质的物理化学和生物性质（如提高溶解度、降低免疫原性、延长半衰期以及防止蛋白酶破坏），从而显著提高其价值。体积排阻色谱法 (SEC) 是检测分子量大于聚乙二醇化蛋白质杂质的首选方法。由于聚乙二醇介导的与硅胶固定相的相互作用会导致回收率降低、峰形变差以及过度拖尾，因此聚乙二醇化蛋白质的 SEC 分析面临着很大挑战。本应用简报描述了一种用于检测聚乙二醇粒细胞集落刺激因子 (PEG GCSF) 的简单而灵敏的 SEC 方法。采用 AdvanceBio SEC, 130Å, 7.8 × 300 mm, 2.7 μm 色谱柱在水相流动相下进行 PEG GCSF 的分离和定量分析。线性曲线在 12.5-2000 μg/mL 的范围内具有优异的相关系数，表明该方法适用于定量分析。该方法具有出色的保留时间和峰面积精度，证明了该方法的适用性。此外，AdvanceBio SEC 还可对强制应激研究中得到的聚集体进行分离与定量分析。前言聚乙二醇化是聚乙二醇 (PEG) 聚合物链与另一个分子发生共价结合的过程，另一个分子通常是药物或治疗性蛋白质。将 PEG 的活性衍生物与目标大分子共同温育通常可实现聚乙二醇化。PEG 基团具备的多项优势有助于提高蛋白质稳定性并延长体内的循环半衰期。美国食品药品监督管理局 (FDA) 已批准 PEG 为公认安全物质。目前已有集中聚乙二醇化产品通过了 FDA 的审批。聚乙二醇粒细胞集落刺激因子 (PEG GCSF) 是一种长效的重组 GCSF，其中含有 GCSF 以及 20 KDa 与甲硫氨酸残基 N 端共价结合的聚乙二醇分子。GCSF 是一个含有 175 个氨基酸的蛋白质，分子量为 18800 道尔顿。PEG GCSF 的总分子量为 39 KDa。各论草案方法推荐使用体积排阻色谱 (SEC) HPLC 测定 PEG GCSF 和更高分子量聚集体的纯度。多数针对 PEG GCSF 的已发布方法采用含有 100 mM NaCl、85% 磷酸以及最多 10% 乙醇的水相流动相以减少非特异性相互作用并改善峰形和分离性能。聚集体有时会比自然形态更易于与固定相结合，因此治疗性蛋白质的不理想吸附是 SEC 分析过程中的一个主要问题。由于这一优先结合趋势，聚集体的 SEC 分析往往并不准确，甚至存在无法检出的风险。使用含有机溶剂或极端 pH 的流动相可解决这一问题，结果表明这种流动相能够提高分离度和回收率。然而，除可能会使可逆聚集体解离外，这种流动相还可能会使配方缓冲液中不可逆的聚集体发生解离。本文展示了用于 SEC 分析的突破性技术 Agilent AdvanceBio SEC, 130Å, 7.8 × 300 mm, 2.7 μm 色谱柱的优势。这款色谱柱采用创新型硅胶填料和特有的亲水键合技术，可使各种样品均获得出色的分离度和体积分离，且无需向流动相中添加有机改性剂。结论本应用简报证明了采用 PEG GCSF 作为模型蛋白质进行聚乙二醇化蛋白质分析的几个出色的解决方案。文中开发出了一种采用 Agilent AdvanceBio SEC 色谱柱，无需在流动相中添加有机改性剂即可监测 PEG GCSF 纯度的简单 SEC HPLC 方法。该方法具有优异的 RT 和峰面积 RSD，并能满足 PEG GCSF 系统适用性要求。PEG GCSF 的 LOD 和 LOQ 分别为 3.125 μg/mL 和 12.5 μg/mL，表明该分析方法具有较高灵敏度。12.5-2000 μg/mL 的 8 个标准偶合物浓度的线性曲线具有极佳的线性相关系数值，表明该方法可实现准确定量分析。此外，治疗性 PEG 蛋白质的应激研究还表明 AdvanceBio SEC 色谱柱可对聚集体进行分离和检测，并能根据峰面积比进行定量分析。将这一简单的重现方法与仪器的生物惰性和耐腐蚀相结合，可使这类解决方案成为生物制药研究中聚乙二醇化蛋白质 QC 分析的可靠适用方法。