胰高血糖素中有机杂质检测方案(液相色谱仪)

使用2D-LC作为 MSD 分析的自动脱盐工具 由 MS 不兼容的 USP 方法直接进行药物多肽的质量选择检测 应用简报 生物制剂与生物仿制药 作者 摘要 Sonja Krieger安捷伦科技有限公司 治疗性多肽和蛋白质的表征及杂质分析需要联合使用色谱分离和质量选择检测。然而，多肽和蛋白质的色谱分离方法通常使用 MS 不兼容的流动相。本应用简报采用多中心切割(MHC)二维液相色谱(2D-LC) 作为质量选择检测的自动脱盐工具。在第一维中，使用 MS不兼容的流动相根据 USP 39分析多肽胰高血糖素。然后在第二维中进行自动脱盐和质量选择检测。 Agilent Technologies 前言 在药物研究和开发中，治疗性多肽和蛋白质受到了越来越多的关注。这些大分子的复杂结构和杂质谱为其表征和杂质分析带来了难题。要解决这些难题，需要联用色谱分离和质量选择检测(MSD)来分析上述分子。多肽和蛋白质的色谱分离方法通常使用MS 不兼容的流动相，例如含有高浓度盐或非挥发性缓冲液的流动相12。为了使这些色谱方法能够使用 MS检测，通常需要将方法转换为 MS 兼容的流动相或收集馏分脱盐后进行离线MS分析。 在二维液相色谱(2D-LC)中，第二维可作为有效的脱盐工具，从而实现使用MS 不兼容流动相的色谱方法与 MS 检测的在线联用。配置二维液相色谱软件 A.01.04 的 AgilentInfinityLab 二维液相色谱解决方案为使用安捷伦单四极杆质谱仪的 MSD联用2D-LC 提供了从方法设置到数据分析的完全集成的解决方案。分流阀可在每次第二维(D)运行开始时自动将第一维(D)流动相中的盐或缓冲液分流至废液。 Agilent AdvanceBio 脱盐反相小柱可用于在第二维中进行快速有效脱盐，如之前的应用简报所述。除了脱盐之外，当使用的标准长度色谱柱和条件可提供与第一维分离不同的选择性时，还可在第二维中实现进 一步分离。 胰高血糖素是一种含有29种氨基酸的多肽类激素，用于低血糖的紧急治疗。根据 USP 39，在流动相中使用磷酸钾缓冲液，通过LC结合 UV检测进行胰高血糖素的有机杂质分析5。而 这与 MS 检测不兼容。本应用简报采用多中心切割(MHC) 2D-LC， 在第一维中根据 USP 39 进行胰高血糖素分析，在第二维中进行自动脱盐和 MSD检测。 实验部分 ( 设 备 ) Agilent InfinityLab 2D-LC解决方案包括以下模块： ( 两台 Agilent 1290 I n finity ll高速 泵 (G7120A) ) ( Agilent 1290 InfinityllMultisampler (G7167B)， 配备冷 去装置(选件#100) ) ( Agilent 1290 Infinity ll高容量柱 温箱 (G7116B) ) ( Agilent 1290 Infinity lI可变波长检 测器 (G7114B)，配备标准流通池 (部件号 G1314-60186) ) ( Agilent 1290 Infini t y 阀驱动(G1170A)，配备2位/4通双向阀 头(二维液相色谱阀 1300 bar： 部件号5067-4244) ) ( 两个 Agilent 1290 Infinity 阀驱动 (G1170A)，配备带40 pL定量环 的多中心切割阀(部件号 G4242- 64000) ) ( Agilent 1290 Infinity 阀驱动(G1170A ) ， 配备2位/6通阀 800 bar (部件号5067-4282) ) ( 质量选择检测采用配备安捷伦喷射流电喷雾离子源(部件号 G1958-65538)的Agilent 6150单四极杆液质联用仪 (G6150BA) 进行。 ) 软件 Agilent OpenLAB CDS ChemStation版，版本 C.01.07 SR3[465]以及二维液相色谱软件，版本A.01.04。 色谱柱 ( Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18， 3 .0×150 mm， 3.5 pm (部件号959963-302) ) ( Agilent AdvanceBio 脱盐反相 小柱，2.1×12.5m m (部件号PL1612-1102)，带小柱柱套 (部件号820999901) ) ( 化学 品 ) 所有试剂纯度均为液相色谱级。乙腈购自 Merck (Darmstadt， Germany)。新制超纯水来自配置0.22 pm 膜式终端过滤器(Millipak) 的 Milli-Q Integral水纯化系统(Millipak，EMD Millipore，Billerica， MA， USA)。磷酸二氢钾、甲酸和胰高血糖素(合成粉末，经过细胞培养测试)购自 Sigma-Aldrich(Steinheim， Germany)。盐酸和磷酸分别购自Merck (Darmstadt，Germany) 和J.T.Baker (Deventer，Netherlands)。 ( 样品 ) ( 将胰高血糖素复溶于0.01 mol/L HCI中配制成浓度约为 0.5 mg/mL 的胰高血糖素标准溶液。按照 USP 39 说明配 制胰高血糖素系统适用性溶液，将约 0.5 mg/mL 胰高血糖素的 0.01 mol/L HCI溶液在50°℃下保存48小时。 ) 方法 结果与讨论 根据 USP 39，在流动相中使用磷酸钾缓冲液，通过 LC 结合 UV检测进行胰高血糖素的有机杂质分析。而这与 MS 检测不兼容。多中心切割二维 液相色谱使用第二维作为有效脱盐工具，从而可将此液相色谱方法与质谱检测在线联用。配置二维液相色谱软件A.01.04的 Agilent InfinityLab二维液相色谱解决方案为使用安捷伦单四极杆质谱仪的 MSD 联用 2D-LC提供 了完全集成的解决方案。为了便于在MS 检测前进行脱盐，在每次第二维(D)运行开始时使用分流阀自动将第一维('D)流动相中的盐或缓冲液分流至废液，如图1所示。 图2为二维液相色谱查看器中胰高血糖素标准溶液基于峰的多中心切割二维液相色谱分析结果。、0二维液相色谱查看器显示了胰高血糖素标准溶液五个'D色谱图的叠加色谱图以及相应的 'D 采样表。二维液相色谱查看器还包括胰高血糖素峰的一次一D 分析的 2DMSD 色谱图， 显示为总离子流色谱图(TIC) 和提取离子色谱图(EIC) 以及相应的质谱图。 图2.显示胰高血糖素标准溶液基于峰的多中心切割二维液相色谱分析结果的二维液相色谱查看器 根据 USP 39，胰高血糖素分析需要满足相关胰高血糖素标准溶液和系统适用性溶液分析的某些系统适用性要求。图3显示了胰高血糖素五次标准溶液分析和胰高血糖素系统适用性溶液分析的D色谱图。在胰高血糖素系统适用性溶液中，可清楚看见胰高血糖素峰后洗脱的四个峰，根据USP39，这些峰归属于胰高血糖素的脱酰氨基化。脱酰氨基化是指分别从天冬酰胺或谷氨酰胺中脱去氨基生成天冬氨酸或谷氨酸。这将使侧链酰胺生成侧链羧酸残基4，质量数增加1 Da。例如，脱酰氨基化是常见的蛋白质降解途径，发生在热应力过程中。多肽胰高血糖素包含一个天冬酰胺和三个谷氨酰胺残基。 表1总结了 USP 39 的相关系统适用性要求，并表明通过二维液相色谱方法的第一维分析极好地满足了这些要求。 图3.根据 USP 39 进行的胰高血糖素分析'D色谱图。A)胰高血糖素标准溶液五次分析的叠加色谱图。B)胰高血糖素系统适用性溶液分析的色谱图 表1.相关的 USP 39 适用性要求以及二维液相色谱方法的'D分析结果 适用性要求 结果 相对标准偏差(RSD)： NMT 2.0%，标准溶液 标准溶液中的胰高血糖素(N=5)： 保留时间 RSD： 0.27%， 面积RSD： 0.11% 拖尾因子：胰高血糖素峰 NMT 1.8，标准溶液标准溶液中的胰高血糖素： USP拖尾：1.3 分离度(Rs)：可清楚看见胰高血糖素峰之后 系统适用性溶液：可清楚看见胰高血糖素峰之 洗脱的四个脱酰胺胰高血糖素峰。主峰和第 后洗脱的四个峰。 一个洗脱的脱酰胺峰之间的分离度 NLT 1.5， 胰高血糖素与第一个洗脱的脱酰胺峰之间的分 系统适用性溶液 离度：2.3 图4展示了二维液相色谱查看器中胰高血糖素标准溶液基于峰的多中心切割二维液相色谱分析的D和²D色谱图。采用 5 mAU 阈值和0.65分钟的采样时间，对'D胰高血糖素峰的峰顶点进行中心切割，然后在第二维中进行分析。在在D MSD色谱图中，在AdvanceBio 脱盐反相小柱上有效捕集胰高血糖素后进行检测。图5为胰高血糖素峰相应的质谱图。通过检测[M+5H]5+、[M+4H]4+和[M+3H]3+离子实现对胰高血糖素的检测。未检测到加合物，表明在第二维中进行了有效脱盐。 图4.胰高血糖素标准溶液基于峰的多中心切割二维液相色谱分析的'D UV和DMSD 色谱图(m/z871.0-872.1的 TIC 和EIC图) 图5.胰高血糖素峰的质谱图 对胰高血糖素系统适用性溶液进行了基于峰和基于时间的多中心切割二维液相色谱分析。基于峰的多中心切割二维液相色谱分析的目的是对胰高血糖素峰以及胰高血糖素脱酰胺基化后的峰进行多中心切割，以获取这些峰的质量数信息。对基于峰的中心切割采用不同的采样时间，可将不同峰宽的峰在其峰顶点附近进行中心切割。图6A显示由于第四个脱酰胺胰高血糖素峰没有与第三个脱酰胺胰高血糖素峰完全分离，在该条件下未进行中心切割。使用基于时间的多中心切割二维液相色谱，，可实现对目标峰(例如胰高血糖素峰、胰高血糖素脱酰胺基化的四个峰以及胰高血糖素其他降解产物的峰)的中心切割(图6B)。采用这种方式，可在第二维中脱盐之后获得所有目标峰的质量数信息。 图7展示了在基于峰的多中心切割二维液相色谱分析后获得的第一个脱酰胺胰高血糖素峰的质谱图。四个脱酰胺胰高血糖素峰的质谱图相似(相关数据未显示)。所观察到的[M+5H]5、[M+4H]4+和[M+3H]3+离子与胰高血糖素峰相比质量数有所增加，证实这些峰归属于胰高血糖素的脱酰胺基化。 图6.使用中心切割的胰高血糖素系统适用性溶液的'D色谱图，(A)基于峰的多中心切割二维液相色谱图(B)基于时间的多中心切割二维液相色谱图 图7.第一个脱酰胺胰高血糖素峰的质谱图 结论 使用 Agilent InfinityLab 二维液相色谱解决方案的多中心切割二维液相色谱(2D-LC)可作为有效的脱盐工具，实现使用 MS 不兼容流动相的色谱方法与质谱检测的在线联用。根据 USP39， 在流动相中使用磷酸钾缓冲液对多肽胰高血糖素进行分析。将此MS不兼容的色谱方法在第二维中脱盐后与质量选择检测联用。未检测到加合物，表明使用 Agilent AdvanceBio 脱盐反相小柱可实现有效脱盐。获得了目标峰(例如胰高血糖素峰和胰高血糖素脱酰胺基化产生的峰)的质量数信息。 ( 1. Luo，H.； et al. 2D-LC as a n on-line desalting tool allowing p eptideidentification directly from MSunfriendly HPLC methods.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2017， 137， 1 39-145 ) ( 2. Petersson， P.； Haselmann， K.； Buckenmaier， S. Multipleheart-cutting two-dimensionalliquid chromatography massspectrometry： Towards r eal time determination of related impurities of bio-pharmaceuticalsin salt based separation methods.Journal of Chromatography A 2016， 1468，95-101 ) ( 3. Suresh， Babu C. V.； Ravindra，G.用 于 2D-LC/MS mAb 分析中在线脱 盐的 Agilent AdvanceBio 脱盐反相 小柱，安捷伦科技公司应用简报， 出版号5991-7066CHCN， 2 016 ) 4.Joshi， A. B.；Rus，E.； Kirsch， L.E. The degradation pathwaysof glucagon in acidic solutions.International Journal ofPharmaceutics 2000，203，115-125 5."Glucagon" Official MonographsUSP 201639，December 1 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价：www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 仅限研究使用。 不可用于诊断目的。 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 C安捷伦科技(中国)有限公司，2017 2017年9月1日，中国出版 5991-8437ZHCN Agilent Technologies 摘要治疗性多肽和蛋白质的表征及杂质分析需要联合使用色谱分离和质量选择检测。然而，多肽和蛋白质的色谱分离方法通常使用 MS 不兼容的流动相。本应用简报采用多中心切割 (MHC) 二维液相色谱 (2D-LC) 作为质量选择检测的自动脱盐工具。在第一维中，使用 MS 不兼容的流动相根据 USP 39 分析多肽胰高血糖素。然后在第二维中进行自动脱盐和质量选择检测。前言在药物研究和开发中，治疗性多肽和蛋白质受到了越来越多的关注。这些大分子的复杂结构和杂质谱为其表征和杂质分析带来了难题。要解决这些难题，需要联用色谱分离和质量选择检测 (MSD) 来分析上述分子。多肽和蛋白质的色谱分离方法通常使用 MS 不兼容的流动相，例如含有高浓度盐或非挥发性缓冲液的流动相。为了使这些色谱方法能够使用 MS 检测，通常需要将方法转换为 MS 兼容的流动相或收集馏分脱盐后进行离线 MS 分析。在二维液相色谱 (2D-LC) 中，第二维可作为有效的脱盐工具，从而实现使用 MS 不兼容流动相的色谱方法与 MS 检测的在线联用1。配置二维液相色谱软件 A.01.04 的 Agilent InfinityLab 二维液相色谱解决方案为使用安捷伦单四极杆质谱仪的 MSD 联用 2D-LC 提供了从方法设置到数据分析的完全集成的解决方案。分流阀可在每次第二维 (2D) 运行开始时自动将第一维 (1D) 流动相中的盐或缓冲液分流至废液。Agilent AdvanceBio 脱盐反相小柱可用于在第二维中进行快速有效脱盐，如之前的应用简报所述。除了脱盐之外，当使用的标准长度色谱柱和条件可提供与第一维分离不同的选择性时，还可在第二维中实现进一步分离。胰高血糖素是一种含有 29 种氨基酸的多肽类激素，用于低血糖的紧急治疗。根据 USP 39，在流动相中使用磷酸钾缓冲液，通过 LC 结合 UV 检测进行胰高血糖素的有机杂质分析。而这与 MS 检测不兼容。本应用简报采用多中心切割 (MHC) 2D-LC，在第一维中根据 USP 39 进行胰高血糖素分析，在第二维中进行自动脱盐和 MSD 检测。结论使用 Agilent InfinityLab 二维液相色谱解决方案的多中心切割二维液相色谱 (2D-LC) 可作为有效的脱盐工具，实现使用 MS 不兼容流动相的色谱方法与质谱检测的在线联用。根据 USP 39，在流动相中使用磷酸钾缓冲液对多肽胰高血糖素进行分析。将此 MS不兼容的色谱方法在第二维中脱盐后与质量选择检测联用。未检测到加合物，表明使用 Agilent AdvanceBio 脱盐反相小柱可实现有效脱盐。获得了目标峰（例如胰高血糖素峰和胰高血糖素脱酰胺基化产生的峰）的质量数信息。