本应用简报介绍了在与质谱不兼容的反相液相色谱法中,采用二维中心切割 LC/MS 方法来鉴定度洛西汀药物中相邻洗脱的杂质。在 Agilent 1260 Infinity 液相色谱系统联用 Agilent 6540 UHD Q-TOF LC/MS 系统上进行本研究的分析。第一维和第二维分离使用 Agilent ZORBAX Eclipse Plus 色谱柱。在第一维液相色谱中,采用了与质谱不兼容的液相色谱 (LC) 方法。柱切换阀将特定的未知杂质转移到第二根液相色谱柱上,然后第二个泵泵送与质谱兼容的流动相将杂质分离。使用 6540 UHD Q-TOF 采集杂质的精确质量数质谱数据和二级质谱数据。使用 Agilent MassHunter 和安捷伦分子结构关联 (MSC) 软件进行数据处理,以快速鉴定未知杂质。该方法能够在用户干预最少的条件下进行高效、准确的杂质分析。
使用Agilent 6540 Q-TOF LC/MS 系充通过二维中心切割 LC/MS 法进行药物杂质鉴定 应用简报制药 作者 Siji Joseph 安捷伦科技有限公司 印度班加罗尔 摘要 本应用简报介绍了在与质谱不兼容的反相液相色谱法中,采用二维中心切割 LC/MS方法来鉴定度洛西汀药物中相邻洗脱的杂质。在 Agilent 1260 Infinity 液相色谱系统联用Agilent 6540 UHD Q-TOF LC/MS 系统上进行本研究的分析。第一维和第二维分离使用Agilent ZORBAX Eclipse Plus 色谱柱。在第一维液相色谱中,采用了与质谱不兼容的液相色谱 (LC) 方法。柱切换阀将特定的未知杂质转移到第二根液相色谱柱上,然后第二个泵泵送与质谱兼容的流动相将杂质分离。使用6540 UHD Q-TOF 采集杂质的精确质量数质谱数据和二级质谱数据。使用 Agilent MassHunter 和安捷伦分子结构关联 (MSC) 软件进行数据处理,以快速鉴定未知杂质。该方法能够在用户干预最少的条件下进行高效、准确的杂质分析。 前言 活性药物成分(API) 中杂质的检测和鉴定对于制药行业来说极为重要。越来越严格的法规环境要求测定 API杂贡的分析方法必须具有高灵敏度且结果准确。国际协调会议(ICH)指南规定必须要鉴定药物中含量大于等于0.1%的杂质。准确了解杂质及其含量有助于更好地控制化学反应过程并获得更高的API纯度。有时,杂质的结构可能与API相似,因此,采用复杂而选择性高的分析方法对于杂质分析来说至关重要。常规的杂质分析法通常需要用到多个仪器平台,非常费时费力。 制药业广泛采用 LC/MS/MS技术进行杂质鉴定,因为这种方法灵敏度高、选择性强、分析速度快。将高压液相色谱(HPLC)系统与四极杆飞行时间质谱(Q-TOF)联用,能够精确测定母离子和碎片离子的质量数。采用诸如 Agilent Mass Hunter生性分析软件中的分子特征提取(MFE) 和分子式生成(MFG)等先进算法,配合 MassHunter分子结构关联软件 (MSC) 进行数据处理,从而进行杂质鉴定和结构解析。安捷伦出版号5991-1375CHCN 详细介绍了采用该方法鉴定欧洲药典指定的阿替洛尔API中的八种杂质。 LC/MS 在使用非挥发性缓冲液作流动相时会存在一些局限。如果原始的液相色谱方法中使用了非挥发性缓冲液,那么色谱工作者必须花额外的时间使用与质谱兼容的流动相开发出等效的液相色谱方法。另外,如果新开发出的、与质谱兼容的液相色谱方法使得杂质的洗脱顺序发生变化,则会带来额外的挑战和不确定性。中心切割法采用两种反相液相色谱条件,能够完全消除这种局限。本应用简报使用了二维液相色谱技术,先使用与质谱不兼容的流动相将目标杂质从第一根色谱柱中洗脱出来,将其转移到第二根色谱柱上,第二根色谱柱使用的是与质谱兼容的液相色谱条件。该方法可以扩展到很多药物成分及相关杂质的分析。 实验部分 仪器 本实验所用的LC/MS 由带喷射流离子源的Agilent 6540 UHD Q-TOF 和 Agilent 1260Infinity 二元液相色谱系统组成。使用的单个模块和色谱柱如下: ( ·用于第一维和第二维分离的 Agilent 1260 Infinity 系列脱气机 (G1379B) ) ( 用于第一维和第二维分离的两个 Agilent 1260 Infinity 二元泵 (G1312B) ) ( ·Agilent 1260 Infinity 高性能自动进样器 (G1367D) ) ( ·带2位/6通色谱柱切换阀的 Agilent 1260 Infinity 柱温箱(G1316B) ) ( · 带 最大光强流通池(4.0pL体积,60mm 光程) ( G 4212-60007) 的 Agilent 1290 Infinity 二极管阵列检测器(G4212A) ) ( ·色谱柱1: Agilent ZORBAX Eclipse Plus C-18色谱柱, 4 .6×250 mm, 5.0 pm (部件号959990-902) ) ( · 色 谱 柱2: Agilent ZORBAX Eclipse Plus C-18色谱柱,4.6×75 mm, 3.5 pm (部件号959933-902) ) ( 软件 ) ( 使用 Agilent ChemStation 软件 (B.04.03版)采集 LC-UV 数据并对杂质的峰面积百分比定量,使用 MassHunter Workstation(B.04.00版)采集液相色谱质谱数据。使 用 MassHunter 定性分析软件 (B0.04.00) 进行数据处理。使用 MassHunter MSC 软件(B.05.00版) 进行杂质的结构解析。 ) 试剂与材料 LC/MS 级的乙腈、甲醇和甲酸购自 Fluka公司(德国)。用于制备流动相的高纯水来自Milli Q水纯化系统(Millipore Elix10型,美国)。磷酸二氢钾购自 Fluka 公司(德国)。度洛西汀及其杂质的标样购自Varda 生物科技公司(印度)。 工作流程 图1使用方框图展示了本实验的仪器配置。使用参考文献3中描述的 HPLC 方法对度洛西汀 API进行杂质分析。对使用Agilent ZORBAX Eclipse Plus C-18,4.6×250 mm, 5.0 pm 色谱柱得到的总的色谱洗脱曲线进行了评估。 使用 HPLC方法1时,杂质在8.7 min 时洗脱(表1)。在另一次进样中,于 8.2 min至9.0 min 时使用2位/6通切换阀改变阀的位置,将未知杂质转移到色谱柱2里。在这一段中心切割时间里,通过三通接头将色谱柱2与泵2连接,泵送与质谱兼容的95%水性流动相。这段时间里通过色谱柱2的总流量为泵1和泵2的流量之和。泵2的流量中水性组分的比例很高,减少了流动相中有机组分的总含量,这样就能将杂质保留在色谱柱2中。9 min 后,色谱柱切换阀回到初始位置,使用泵1将色谱柱1中流出的洗脱液引入 DAD里, 进行UV分析。 从9 min 起,色谱柱2中的流量完全来自泵2。泵2中依然保持95%的水性流动相12 min。这个时间足以冲洗出色谱柱2中的所有缓冲液。而此时,通过 Q-TOFRheodyne 进样口,色谱柱2中的液体流入废液容器中。从12 min起,使用泵2运行梯度以洗脱色谱柱2中捕集的杂质。洗脱液夜入Q-TOF 质谱仪, 并在自动MS/MS模式下采集数据。 图1 本实验的仪器配置方框图。柱温箱中包含两根色谱柱,并与一个6通切换阀连接 图2是中心切割方法中阀位置的示意图, 图3是整个流程示意图。 图2 中心切割之前、期间和之后的阀位。红色表示使用与质谱不兼容的流动相的流的(1),绿色表示使用与质谱兼容的流动相的流路(2) M HPLC分离(色谱柱1,泵1)使用泵1、色谱柱1和与质谱不兼容的流动相三 进行DAD分析 通过色谱柱切换阀将(仅)杂质峰转移至色谱柱2上。使用泵2冲洗色谱柱2 MA LC/MS分析(色谱2,泵2)使用 Agilent 6540 Q-TOF 分析捕集的杂质,先进行MS全扫描,然后进行自动MS/MS扫描 使用 MFE 和 MFG算法,利用精确质量数的质谱数据和二级质谱数据鉴定杂质 使用 MSC 进行杂质的结构解析 图3 使用中心切割法进行杂质鉴定的工作流程 仪器参数 仪器参数列于表1和表2。 参数 HPLC: 条件1(与质谱不兼容) HPLC:条件2(与质谱兼容) 色谱柱 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C-18, Agilent ZORBAX Eclipse Plus C-18, 4.6×250mm, 5.0 pm 4.6×75 mm, 3.5 pm 流速 1.0 mL/min 见梯度 流动相A 等度:20mM磷酸钠缓冲液: 乙:甲醇;55:37:8 0.1%甲酸水溶液 流动相B 不适用 0.1%甲酸乙腈溶夜 检测器 DAD: 229nm Q-TOF 进样量 5uL 不适用 针头清洗 使用甲醇清洗8s 不适用 泵模式 泵:1,等度 30 min 泵:2,梯度 表1 Agilent 1200 系列液相色谱仪参数 Q-TOF MS 与自动 MS/MS 条件 质谱仪 Agilent 6540 Q-TOF 离子源 AJS ESI 采集模式 2 GHz, 扩展的动态范围 离子极性 正离子模式 干燥气温度 325°C 干燥气流速 10 L/min 雾化器压力 45 psig 鞘气温度 375°C 鞘气流速 12 L/min 毛细管电压 4,000 V 喷嘴电压 500V 碎裂电压 90V 采集 MS接续自动 MS/MS 表2 Agilent 6540 Q-TOF 参数 结果与讨论 图4显示了LC-UV分析得到的度洛西汀API 的洗脱曲线。未知杂质(保留时间:8.7min)的峰面积百分比大约为0.1%。图5显示中心切割分析时通过Q-TOF得到的总离子流图(TIC)。 图4 使用 LC-UV法分析度洛西汀得到的洗脱曲线(标记出了基线的中心切割区域) 图5 Q-TOF分析得到的总离子流图(TIC) 列于表中,并根据它们的相对可能性大小进行了排序(图7)。 使用 MassHunter 定性分析软件的 MFE和 MFG 算法进行数据分析。MFE 算法可提取所有样品组分的高分辨精确质谱信息。从采集的数据中, MFE 算法会列出两个实 体(峰),其m/z值分别为 298.1257 和312.1416(图6)。m/z 298.1257 对应度洛西汀 API, m/z 312.1416对应未知杂质。MFG 算法将每个实体的一系列候选分子式 图7 度洛西汀及杂质的 MFE/MFG 结果 将利用MFE/MFG 得到的API和未知杂质的母离子和碎片离子的精确质量数信息上传到 MSC 软件中, 并在 ChemSpider数据库中检索,以得到所有可能的结构。关于 MSC 软件以及鉴定杂质的多种方法 的详细信息可参考安捷伦出版物5991-1375CHCN。检索出了两个实体的多个候选结构以及计算出的相关性得分。经确认,其中一个列出的实体是度洛西汀 API。图8显示了未知杂质的 MSC 软件分析结 果的屏幕截图。所选母离子的总体 MFG得分、MSC 可能结构的排序以及杂质的结构相关性得分都用红圈突出显示。相关性得分最高(93.26%)的结构对应的是度洛西汀API的甲基衍生物。 图8 未知杂质 MSC 鉴定结果的屏幕截图 A:杂质母离子可能的分子式列表 B:杂质子离子的 MFG结果 C:未知杂质的可能结构 D:图C中选择的可能结构的碎片离子 图9总结了 MSC 得到的未知杂质的结构解 析。通过加入杂质标样来进一步确认杂质。 图9 度洛西汀杂质(m/z 311.1344)的结构解析结果表明MSC软件可广泛用于各个碎片离子的结构确定 图10给出了向 API样品中加标杂质标样后峰面积百分比的增加情况。 图10 当度洛西汀的甲基衍生物添加到 API后, 用 DAD 检测到的杂质峰面积百分比的增加情况 ( 本应用简报阐述了选择性鉴定杂质的工作流程。该工作流程使用了二维中心切割 LC/MS 法来鉴定度洛西汀API 中的杂质。该方法无需再开发与质谱兼容的液相色谱方法,使用与质谱不兼容的药典方法即能对目标杂质进行准确的质谱分析。使用该方法能够选择特定的相邻洗脱的低含量 API 中未知杂质进行质谱分析。使用 Agilent 6540 Q-TOF 配合先进的软件工具 (MSC 、 MFE 和 MF G ) 能够对未知化合物实现快速、可靠的鉴定。 ) ( 参考文献 ) 1. ( 人用药品注册技术要求国际协调会议,ICH 指导委员会,1995年3月30日 ) ( 2. ) ( 安捷伦出版号5991-1375CHCN“Agilent Q-TOF LC/MS 和先进的 MassHunter数据处理软件结合使用进行药物杂质的鉴定 和分析”,2012年11月21日 ) 3. ( Validated reverse phase method f or duloxetine from International Journa/ of Comprehensive Pharmacy(IJCP), Vol 0 1, and Issue 0 3 . V i riyala R. K. et al. Pharmacie G l obale (IJCP), 3 ( 03) 2010 ) www.agilent.com/chem/cn @安捷伦科技(中国)有限公司,2013 2013年3月1日,中国出版 5991-1873CHCN Agilent Technologies Agilent Technologies 摘要本应用简报介绍了在与质谱不兼容的反相液相色谱法中,采用二维中心切割 LC/MS 方法来鉴定度洛西汀药物中相邻洗脱的杂质。在 Agilent 1260 Infinity 液相色谱系统联用 Agilent 6540 UHD Q-TOF LC/MS 系统上进行本研究的分析。第一维和第二维分离使用 Agilent ZORBAX Eclipse Plus 色谱柱。在第一维液相色谱中,采用了与质谱不兼容的液相色谱 (LC) 方法。柱切换阀将特定的未知杂质转移到第二根液相色谱柱上,然后第二个泵泵送与质谱兼容的流动相将杂质分离。使用 6540 UHD Q-TOF 采集杂质的精确质量数质谱数据和二级质谱数据。使用 Agilent MassHunter 和安捷伦分子结构关联 (MSC) 软件进行数据处理,以快速鉴定未知杂质。该方法能够在用户干预最少的条件下进行高效、准确的杂质分析。前言活性药物成分 (API) 中杂质的检测和鉴定对于制药行业来说极为重要。越来越严格的法规环境要求测定 API 杂质的分析方法必须具有高灵敏度且结果准确。国际协调会议 (ICH) 指南规定必须要鉴定药物中含量大于等于 0.1% 的杂质。准确了解杂质及其含量有助于更好地控制化学反应过程并获得更高的 API 纯度。有时,杂质的结构可能与 API 相似,因此,采用复杂而选择性高的分析方法对于杂质分析来说至关重要。常规的杂质分析法通常需要用到多个仪器平台,非常费时费力。制药业广泛采用 LC/MS/MS 技术进行杂质鉴定,因为这种方法灵敏度高、选择性强、分析速度快。将高压液相色谱 (HPLC) 系统与四极杆飞行时间质谱 (Q-TOF) 联用,能够精确测定母离子和碎片离子的质量数。采用诸如 Agilent Mass Hunter 定性分析软件中的分子特征提取 (MFE) 和分子式生成 (MFG) 等先进算法,配合 MassHunter 分子结构关联软件 (MSC) 进行数据处理,从而进行杂质鉴定和结构解析。安捷伦出版号 5991-1375CHCN 详细介绍了采用该方法鉴定欧洲药典指定的阿替洛尔 API 中的八种杂质。LC/MS 在使用非挥发性缓冲液作流动相时会存在一些局限。如果原始的液相色谱方法中使用了非挥发性缓冲液,那么色谱工作者必须花额外的时间使用与质谱兼容的流动相开发出等效的液相色谱方法。另外,如果新开发出的、与质谱兼容的液相色谱方法使得杂质的洗脱顺序发生变化,则会带来额外的挑战和不确定性。中心切割法采用两种反相液相色谱条件,能够完全消除这种局限。本应用简报使用了二维液相色谱技术,先使用与质谱不兼容的流动相将目标杂质从第一根色谱柱中洗脱出来,将其转移到第二根色谱柱上,第二根色谱柱使用的是与质谱兼容的液相色谱条件。该方法可以扩展到很多药物成分及相关杂质的分析。结论本应用简报阐述了选择性鉴定杂质的工作流程。该工作流程使用了二维中心切割 LC/MS 法来鉴定度洛西汀 API 中的杂质。该方法无需再开发与质谱兼容的液相色谱方法,使用与质谱不兼容的药典方法即能对目标杂质进行准确的质谱分析。使用该方法能够选择特定的相邻洗脱的低含量 API 中未知杂质进行质谱分析。使用 Agilent 6540 Q-TOF 配合先进的软件工具(MSC、MFE 和 MFG)能够对未知化合物实现快速、可靠的鉴定。
还剩10页未读,是否继续阅读?
安捷伦科技(中国)有限公司为您提供《药物中杂质鉴定检测方案(液质联用仪)》,该方案主要用于原料药中含量测定检测,参考标准--,《药物中杂质鉴定检测方案(液质联用仪)》用到的仪器有Agilent 6545 Q-TOF 液质联用系统、Agilent 1260 Infinity II 液相色谱系统、Agilent 1290 Infinity II Multisampler、OpenLAB 软件