雷尼替丁原料药与成品药中NDMA 遗传毒性杂质检测方案(液质联用仪)

使用高分辨率 Agilent 6546 LC/Q-TOF测定雷尼替丁原料药与成品药中的NDMA遗传毒性杂质 作者 Chander ManiSaikat Banerjee 安捷伦科技有限公司 杂质是依赖 FDA 批准的安全有效药物的患者和消费者高度关注的问题。雷尼替丁和尼扎替丁均为 H2受体阻滞剂，可降低胃中的酸含量，用于治疗胃炎和胃溃疡。雷尼替丁原料药与成品药中均检出过一种致癌性亚硝胺杂质，导致许多这类药物被召回。行业需要一种分析方法来检测这些致癌性亚硝胺杂质。雷尼替丁因疑含有N-二甲基亚硝胺 (NDMA)，是最近被召回的药物之一。本应用简报描述了一种使用Agilent 6546 LC/Q-TOF 的灵敏高分辨率 LC/MS/MS 方法，用于检测与定量雷尼替丁原料药和成品药中的 NDMA。 FDA 宣布召回雷尼替丁成品药，因为这些药物中可能含有亚硝胺杂质，这也使得NDMA杂质(图1)成为了 FDA 和EMA等监管机构关注的重点。这些亚硝基化合物被列为可能的人类致癌物，它们是生产过程中的痕量副产物，并由此被引入药物成品中。最近， USFDA 在某些批次的雷尼替丁药品中检出了 NDMA。 基于液相色谱/质谱联用系统的方法通常具有高灵敏度和高特异性，已成为检测和定量雷尼替丁原料药与成品药中 NDMA的方法开发基础。本应用简报描述的方法在6546 LC/Q-TOF 仪器上进行，在极低检测限下实现了 NDMA 的全面分析。本应用简报还展示了高分辨率6546 LC/Q-TOF的高灵敏度。 图1.NDMA的化学结构 化学品与试剂 本研究使用的一种 NDMA 标准品来自当地PS3 Labs LLP (Hyderabad， TS，India)。其他 LC/MS级溶剂(如甲醇、水)购自Honeywell (Charlotte， NC， USA)。甲酸购自 Fluka (现属于Honeywell)。 表 1. UHPLC 配置和设置 参数 值 仪器 Agilent 1290 Infinity II高速泵 (G7120A) Agilent 1290 Infinity II Multisampler (G7167B) Agilent 1290 Infinity ⅡI高容量柱温箱 (G7116B) Agilent 1290 Infinity ll可变波长检测器 (G7114B) 进样针清洗 甲醇：水(80：20 v/v) 样品稀释剂 水：甲醇(95：5 v/v) Multisampler 温度 6℃ 进样量 20 pL 分析柱 Agilent InfinityLab Poroshell HPH-C18，4.6×150 mm，2.7 pm(部件号693975-702) 柱温 40°C 流动相A 0.2%甲酸水溶液 流动相B 甲醇 流速 0.3 mL/min 梯度 0 时间 (min) %A %B 流速(mL/min)95 5 0.3 6 92 8 0.36.1 92 8 0.511 5 95 0.511.1 5 95 0.311.2 95 5 0.314 95 5 0.3 停止时间 14 min 波长 300 nm， 320 nm Q-TOF 质谱仪配置和参数 表2.质谱仪配置和离子源设置 仪器 Agilent 6546 LC/Q-TOF 离子源 大气压化学电离(APCI) MS模式 质谱仪 电离模式 正离子 干燥气温度 300°℃ 干燥气流速 6L/min 雾化器压力 45 psi APCI 加热器 350°C APCI喷雾针，正离子模式 4pA 正离子化的毛细管电压 3000V 质量数范围 m/z 70-170 分析物的 MS化合物信息 表 3. Agilent 6546 LC/Q-TOF 的详细 MS设置 时间段 开始时间(min) 质量范围(m/z) 碎裂电压(V) 分流阀位置 1 0 70-170 120 废液 2 6.5 70-170 120 质谱仪 3 8.2 70-170 120 废液 数据分析 采集数据，使用 Agilent MassHunter LC/MS数据采集软件10版对6546 LC/Q-TOF 采集的数据进行分析。使用 Agilent Masshunter定量分析软件10版7((适用于TOF)对NDMA 进行定量分析。 结果与讨论 校准浓度范围为0.25-100 ng/mL(表4).NDMA (m/z 75.0553)的R²值大于0.9997， 在整个浓度范围内表现出线性 响应。图2显示了 5 ng/mL NDMA 的代表性提取离子色谱图和以及雷尼替丁UV色谱图，图中展示出洗脱模式。表3所示的分流阀程序用于将高浓度雷尼替丁分流至废液中。 表 4. Agilent 6546 LC/Q-TOF 的结果汇总。数据包括信噪比 (S/N)、计算得到的定量限 (LOQ)、回归系数、校准曲线拟合结果和线性范围。 NDMA 采用线性函数和1/x加权的校准曲线 化合物 检测限(ng/mL) 检测限 (S/N) LOQ(ng/mL) LOQ(S/N) R² 校准曲线 线性范围(ng/mL) NDMA 0.15 18.8 0.25 47.48 0.9997 线性 0.25-100 图2.显示洗脱模式的代表性 NDMA (5 ng/mL) MRM 色谱图以及雷尼替丁 UV 色谱图 准确度和重现性 NDMA 的校准曲线表明在各校准浓度下，准确度均处于预期浓度的±20%以内，且所有浓度下的变异系数 (CV) 均小于15%，表现出重现性(图3)。图4A、图4B与表5详细比较了不同浓度下的准确度和重现性。 Sample NDMA M. NDMA Results Name Data File Type Level DiL. Exp. Conc. RT Resp. MI Calc. Conc. Final Conc. Accuracy Mass Accuracy S/N Blank Blank-r002.d Blank 1.0000 0.25 ppb 0.25 ppb-r001.d Cal 1 1.0000 0.2500 7.496 33707 0.2061 0.2061 82.4 -1.3770 47.46 0.5ppb 0.5ppb-r001.d Cal 2 1.0000 0.5000 7.497 53629 0.4461 0.4461 89.2 -0.2417 92.22 0.5ppb 0.5 ppb-r002.d Cal 2 1.0000 0.5000 7.465 53993 0.4505 0.4505 90.1 -2.0896 140.60 1ppb 1ppb-r001.d Cal 3 1.0000 1.0000 7.476 104775 1.0625 1.0625 106.2 -2.0565 184.65 1ppb 1 ppb-r002.d Cal 3 1.0000 1.0000 7.480 104836 1.0632 1.0632 106.3 -2.0449 230.68 1 ppb 1 ppb-r003.d Cal 3 1.0000 1.0000 7.481 104316 1.0569 1.0569 105.7 -1.7189| 368.90 1 ppb 1 ppb-r004.d Cal 3 1.0000 1.0000 7.482 100169 1.0070 1.0070 100.7 -2.2917 99.90 1 ppb 1 ppb-r005.d Cal 3 1.0000 1.0000 7.483 100928 1.0161 1.0161 101.6 -1.2478 357.81 1ppb 1 ppb-r006.d Cal 3 1.0000 1.0000 7.480 105196L 1.0675 1.0675 106.8 -1.3829 160.20 5ppb 5 ppb-r001.d Cal 4 1.0000 5.0000 7.474 452997 5.2586 5.2586 105.2 -0.8311 1209.04 5 ppb 5ppb-r002.d Cal 4 1.0000 5.0000 7.475 445129 5.1637 5.1637 103.3 -1.3531 560.45 10 ppb 10 ppb-r001.d Cal 5 1.0000 10.0000 7.474 856882 10.1254 10.1254 101.3 -0.9374 1438.92 10 ppb 10 ppb-r002.d Cal 5 1.0000 10.0000 7.489 864754 10.2203 10.2203 102.2 -1.7301 1477.89 25 ppb 25 ppb-r001.d Cal 6 1.0000 25.0000 7.471 2063008 24.6593 24.6593 98.6 -1.2186 2690.34 25ppb 25 ppb-r002.d Cal 6 1.0000 25.0000 7.469 2114326 25.2777 25.2777 101.1 -0.8898 2937.14 50 ppb 50 ppb-r001.d Cal 7 1.0000 50.0000 7.470 4190567 50.2965 50.2965 100.6 -1.0925 4673.75 50ppb 50 ppb-r002.d Cal 7 1.0000 50.0000 7.470 4149707 49.8042 49.8042 99.6 -1.9279 6299.63 100 ppb 100 ppb-r001.d Cal 8 1.0000 100.0000 7.468 8266473 99.4115 99.4115 99.4 -1.4094 12159.20 100 ppb 100 ppb-r002.d Cal 8 1.0000 100.0000 7.468 8286854 99.6571 99.6571 99.7 -1.5509 11701.05 图 4A.利用 Agilent 6546 LC/Q-TOF 在不同浓度下得到的代表性准确度和重现性 Sample NDMA M.. NDMA Results Name Data File Type Level DiL Exp. Conc. RT Resp. MI Calc.Conc. Final Conc. ACCuracy Mass Accuracy S/N Ranitidine Tablet Ranitidine Tablet-r001.d Sample 0.0333 7.468 664819 7.8110 0.2601 -2.3708 839.15 Ranitidine Tablet Ranitidine Tablet-r002.d Sample 0.0333 7.452 668811C 7.8591 0.2617 -2.6682 568.31 Ranitidine Tablet Ranitidine Tablet-r003.d Sample 0.0333 7.466 663197 7.7915 0.2595 -2.5419 989.69 Ranitidine Tablet Ranitidine Tablet-r0001.d Sample 0.0333 7.465 692599 8.1458 0.2713 -2.7911 825.24 Ranitidine Tablet Ranitidine Tablet-r0002.d Sample 0.0333 7.449 685728 8.0630 0.2685 -0.2582 893.10 Ranitidine Tablet Ranitidine Tablet-r0003.d Sample 0.0333 7.450 698539 8.2173 0.2736 -2.6450 1686.68 1 ppb 1ppb-r008.d Sample 1.0000 7.463 102906 1.0399 1.0399 -1.9600 133.72 1ppb 1 ppb-r009.d Sample 1.0000 7.464 100057 1.0056 1.0056 -1.0172 232.91 1 ppb 1 ppb-r010.d Sample 1.0000 7.481 101921 1.0281 1.0281 -1.7069 157.19 API 1 API 1-r001.d Sample 0.0333 7.461 174701C 1.9051 0.0634 -1.4023 339.36 API 1 API 1-r002.d Sample 0.0333 7.452 175971 1.9204 0.0639 -1.6121 296.57 API2 API 2-r001.d Sample 0.0333 7.451 330214 3.7790 0.1258 -2.0371 603.20 API2 APl2-r002.d Sample 0.0333 7.452 331673C 3.7966 0.1264 -2.2190 813.07 API3 API3-r001.d Sample 0.0333 7.449 272822C 3.0874 0.1028 -1.4437 500.36 API3 API3-r002.d Sample 0.0333 7.450 271769 3.0748 0.1024 -1.5514 482.95 API 4 API4-r001.d Sample 0.0333 7.451 203712C 2.2547 0.0751 -0.9700 351.73 API4 API 4-r002.d Sample 0.0333 7.449 206482 2.2880 0.0762 -1.4015 360.87 Tablet 1 Tablet 1-r001.d Sample 0.0333 7.448 1781536 21.2675 0.7082 -0.6552 3700.62 Tablet 1 Tablet 1-r002.d Sample 0.0333 7.447 1790194 21.3719 0.7117 -0.7234 2645.69 Tablet 2 Tablet 2-r001.d Sample 0.0333 7.448 4235224 50.8346 1.6928 -0.8068 9141.63 Tablet 2 Tablet 2-r002.d Sample 0.0333 7.449 4232781C 50.8052 1.6918 -0.1469 7276.58 图 4B. 利用 Agilent 6546 LC/Q-TOF 在不同样品浓度下得到的代表性重现性。注： API1、API2、API3和API4代表不同批次的原料药，其中API1用于回收率实验的加标。同样，雷尼替丁片剂1和片剂2代表不同批次的雷尼替丁片剂，其中片剂1用于回收率实验的加标 表5.利用 Agilent 6546 LC/Q-TOF 在1ng/mL的浓度下得到的代表性重现性 编号 1ng/mL 的响应 1 104775 2 104836 3 104316 4 100169 5 100928 6 105196 7(插值) 102906 8(插值) 100057 9(插值) 101921 平均值 102789 SD 2086.22 RSD (%) 2.03 Sample NDMA M... NDMA Results Name Data File Type Level Dil. Exp. Conc. RT Resp. MI Calc. Conc. Final Conc. Accuracy Mass Accuracy S/N API 1 API 1-r001.d Sample 0.0333 7.461 174701C 1.9051 0.0634 -1.4023 339.36 API 1 API 1-r002.d Sample 0.0333 7.452 175971 1.9204 0.0639 -1.6121 296.57 Tablet 1 Tablet 1-r001.d Sample 0.0333 7.448 1781536 21.2675 0.7082 -0.6552 3700.62 Tablet 1 Tablet 1-r002.d Sample 0.0333 7.447 1790194口 21.3719 0.7117 -0.7234 2645.69 Spike Standard6 ppb Spike Standard 6 ppb-r001.d Sample 1.0000 7.466 457476 5.3125 5.3125 -0.3589 882.27 Spike Standard 6 ppb Spike Standard 6 ppb-r002.d Sample 1.0000 7.464 485174 5.6463 5.6463 -1.0769 1221.93 Spike Standard 48 ppb Spike Standard 48 ppb-r001.d Sample 1.0000 7.462 3653515 43.8250 43.8250 0.5924 6178.42 Spike Standard 48 ppb Spike Standard 48 ppb-r002.d Sample 1.0000 7.461 3625056 43.4821 43.4821 0.6249 6459.37 Blank Blank-r00001.d Sample 1.0000 API 1_Spike 6ppb API 1_Spike 6 ppb-r001.d Sample 0.0333 7.434 615840 7.2208 0.2405 1.6787 934.18 API 1_Spike 6 ppb API 1_Spike 6 ppb-r002.d Sample 0.0333 7.434 620887 7.2816 0.2425 0.9507 1130.88 API 1_Spike 6 ppb API 1_Spike 6 ppb-r003.d Sample 0.0333 7.432 616494 7.2287 0.2407 1.5689 1995.76 Tablet1_Spike 48 ppb Tablet1_Spike 48 ppb-r001.d Sample 0.0333 7.428 5197274 62.4274 2.0788 1.6808 10813.26 Tablet1_Spike 48 ppb Tablet1_Spike 48 ppb-r002.d Sample 0.0333 7.429 5216955 62.6646 2.0867 1.7166 10814.71 Tablet1_Spike 48 ppb Tablet1_Spike 48 ppb-r003.d Sample 0.0333 7.435 5224481 62.7553 2.0898 1.4057 6946.74 图5.利用 Agilent 6546 LC/Q-TOF 在不同浓度下得到的代表性回收率数据 注：回收率实验在较高浓度下进行，因为原料药和成品药均已含有一定量的NDMA 表6A.6 ng/mL浓度雷尼替丁原料药的回收率实验汇总 亚硝胺杂质 雷尼替丁 API (30 mg/mL)的 加标浓度(ng/mL) 回收率% NDMA 6 93.86 表6B.48 ng/mL浓度雷尼替丁成品药的回收率实验汇总 亚硝胺杂质 雷尼替丁 API (30 mg/mL)的 加标浓度 (ng/mL) 回收率% NDMA 48 94.16 ( Agilent 6546 LC/Q-T O F 高分辨率 LC/MS/MS 能够分析低浓度水平的NDMA亚硝胺杂质。高分辨率质谱仪能够可靠检 测雷尼替丁原料药与成品药的亚硝胺化 合物。本应用简报证明了6546 LC/Q-TOF仪器在检测低浓度 NDMA 方面的灵敏 度。本方法的质量准确度优异，能够对 尼替丁中的 NDMA 进行可靠定量分析。 由于分析雷尼替丁片剂时检出了高浓度 NDMA 的存在，这使得本方法可用于满足USFDA 对雷尼替丁原料药与成品药中低浓度 NDMA 的检测要求。 ) 1. ( USFDA guidance document：Development and Validation ofa RapidFire-MS/MS Method forScreening of Nitrosamine Impurities ) 2. ( USFDA guidance document： LiquidChromatography-High ResolutionMass Spectrometry (LC-HRMS) Method for the Determination of Six Nitrosamine Impurities i n ARB Drugs ) ( 3. 使用高分辨率 Agilent 6546 LC/Q-TOF 测定亚硝胺杂质，安捷伦科技公司应用简报，出 版 号 5994-1372ZHCN， 2019 ) 4. FDA guidance document： LiquidChromatography-High ResolutionMass Spectrometry (LC-HRMS)Method for the Determination ofNDMA in Ranitidine Drug Substanceand Drug Product 5. https：//www.fda.gov/news-events/press-announcements/statement-alerting-patients-and-health-care-professionals-ndma-found-samples-ranitidine ( 致谢 ) ( 我们衷心感谢 PS3 Labs LLP， Hyderabad， TS ， India 为我们提供 NDMA标准品。 ) 查找当地的安捷伦客户中心：www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 Agi l ent 6546 LC/Q-TOF 高分辨率LC/MS/MS 能够分析低浓度水平的 NDMA亚硝胺杂质。高分辨率质谱仪能够可靠检测雷尼替丁原料药与成品药的亚硝胺化合物。本应用证明了 6546 LC/Q-TOF仪器在检测低浓度 NDMA 方面的灵敏度。本方法的质量准确度优异，能够对尼替丁中的 NDMA 进行可靠定量分析。由于分析雷尼替丁片剂时检出了高浓度NDMA 的存在，这使得本方法可用于满足USFDA 对雷尼替丁原料药与成品药中低浓度 NDMA 的检测要求。