4-氨基吡啶溶液中两种潜在致突变性杂质3-氨基吡啶和异烟酰胺检测方案(液质联用仪)

应用简报 Agilent制药与生物制药Trusted Answers 药品中潜在致突变性杂质的痕量水平定量分析 使用 Agilent UItivo LC/TQ 的混合模式数据采集功能 Theresa Sosienski 和Kyle Covert 安捷伦科技有限公司 本应用简报重点介绍了一种分析方法，用于精确定量两种潜在致突变性杂质3-氨基吡啶和异烟酰胺，这两种杂质可由达伐吡啶中的活性药物成分(API) 4-氨基吡啶形成。Agilent Ultivo LC/TQ 具有混合模式采集功能，通过该功能可以同时采集样品的定量 (SIM 和MRM)及定性信息(全扫描和产物离子扫描)。混合模式的工作原理是将扫描功能与目标分析物的 SIM 或 MRM 整合到同一时间段内。实验表明该方法具有优异的灵敏度和精度，潜在致突变性杂质的定量限远低于法规要求。 前言 在 API 的生产过程中，具有致突变性的原料或副反应产物可能会存在于生产批次中。这些致突变性杂质可能会被引入到最终产品中，因此，必须对生产批次中的潜在致突变性杂质 (PMI) 进行筛查。在本分析方法中，我们分析了达伐吡啶中的API，即4-氨基吡啶产生的3-氨基吡啶和异烟酰胺。达伐吡啶的标准剂量为20mg/天，意味着总 PMI 需要精确检测到低于 75 ppm (毒理学关注的 PMI阈值=1.5ug/天)11.2。本应用简报展示了在高浓度的API中，使用具有混合模式采集功能的 Ultivo LC/TQ分析的两种PMI一3-氨基吡啶和异烟酰胺的定量分析。通常，这种类型的分析需要用到 LC/UV或单四极杆 LC/MS。然而，使用 LC/TQ可以更精确地定量分析，因为该系统提高了寻找已知杂质的特异性，且因为降低了化学噪音而具有更高的灵敏度。 Ultivo 的混合模式采集功能允许在同一时间段内同时采集 MRM、SIM、产物离子扫描、母离子扫描和中性丢失扫描数据。这种混合模式功能允许用户收集更多信息，并可在一次进样中精确定量目标化合物。根据法规的灵敏度要求，标准ESI离子源是本应用经济合理的选择。 这种方法的一个难题是需要从相对高浓度的 API中检测 PMI 化合物。分离度在此方法中非常重要，因为杂质后洗脱的 API浓度很高。由于此方法中的分析物具有亲水性，故它们在传统反相色谱柱上的保留性较差。因此，我们采用极强的亲水相互作用液相色谱柱 (Agilent InfinityLabPoroshell 120 HILIC-Z色谱柱)分离分析物。最后，当API从色谱柱中洗脱时，液相色谱流路被移出MS，避免了离子源的潜在污染和质谱检测器的饱和。 ( 试剂与化学品 ) ( 本应用简报中使用的所有试剂均为HPLC 或 LC/MS 级 。 乙腈购自 Honeywell (Morristown， NJ， U SA)。超纯水产自配置 LC-Pak Polisher 和 0.22 um 终端膜式过滤 器 (Merck， D armstadt， Germany) 的 Milli-Q Integral 水纯化系统。 甲 酸购自 Fisher Scientific (Fair Lawn ， NJ ， USA)， 5 mol/L 甲酸铵溶液购自安捷伦科技公司 (SantaClara， CA， USA)(部件号 G 1946-85021)。药物和杂质标准品购自Millipore-Sigma (Merck， Darmstadt， Germany)。 ) 样品前处理 使用20 mg/mL 的4-氨基吡啶溶液作为杂质的基质。用乙腈将4-氨基吡啶稀释至20 mg/mL。用乙腈将3-氨基吡啶和异烟酰胺溶解并稀释到 10 pg/mL 的储备液浓度。用20 mg/mL的4-氨基吡啶储备液进行连续稀释，得到3-氨基吡啶和异烟酰胺的校准曲线。 ( 仪器和实验参数 ) ( Agilent 1260 Infinity II Prime 液相色谱系统1260 Infinity II全能泵 (G7104C) ) ( 1260 InfinitylI 样品瓶进样器 ， 带有集成式柱温箱 (G7129A) ) ( 1260 Infinity lI二极管阵列检测器 HS (G7117C) ) ( Agilent Ultivo 三重四极杆液质联用系统 电喷雾离子源 (G1948B) ) 软件 ( 具有 Quant-My-Way 功能的 AgilentMassHunter 定量分析软件 B.09 ) 采用进样器预处理序列分析样品，用水和甲醇清洗针头和进样器定量环，然后在进样前用初始流动相条件冲洗。由于每个样品中都含有高浓度的4-氨基吡啶，因此可以在 Agilent Masshanter 采集软件中对该进样序列轻松地进行编程，以尽量减少进样之间的交叉污染。液相色谱方法在安捷伦应用简报 5994-0864EN3的基础上略作修改。表1列出了HPLC 梯度条件，表2列出了 ESI 离子源和 Ultivo LC/TQ 参数。 表 1. Agilent 1260 InfinitylI Prime 液相色谱仪参数 使用混合模式采集功能进行 MRM 和扫描方法设置 参数 值 色谱柱 Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z， 2.1×150 mm， 2.7 pm， 带 PEEK 内衬(部件号673775-924) 柱温 35c 进样量 1pL 流动相 A) 10 mmol/L 甲酸铵+0.02%甲酸的水溶液B) 0.1%甲酸的乙腈溶液 流速 0.5 mL/min 梯度 时间(min) %B 0 95 2 904 60 8 60 停止时间 8.0 min 后运行时间 6.0 min 检测 UV [265， 10/参比波长360， 80] nm 图1显示了未知化合物的扫描参数和针对目标 PMI 的 MRM 参数。 Ultivo LC/TQ 提供了同时采集 MRM 和扫描数据的能力。 表2. ESI 离子源参数 参数 值 气体温度 350℃ 气体流速 10 L/min 雾化器压力 40 psi 毛细管电压 4000 V(+) 液相流转移至废液 3 min Acquisition Parameters Scan type Polarity Compound/Segmentname Precursor(m/z) MS1res Product (m/z) MS2 rangestart (m/z) MS2 rangeend(m/z) MS2res Scan/Dwelltime (ms) Frag(V) ISTD? CE(V Threshold Scan Positive 70 400 300 110 MRM Positive 3-aminopyridine 95.1 Unit 68.1 Unit 100 110 20 MRM Positive 3-aminopyridine 95.1 Unit 52 Unit 100 110 回 44 MRM Positive 3-aminopyridine 95.1 Unit 41.1 Unit 100 110 28 MRM Positive Isonicotinamide 123.1 Unit 80 Unit 100 110 20 MRM Positive Isonicotinamide 123.1 Unit 53 Unit 100 110 32 MRM Positive Isonicotinamide 123.1 Unit 52 Unit 100 110 52 图1.设置混合模式扫描与将扫描行添加到 MRM 列表一样简单 方法线性、灵敏度和精度 配备标准 ESI离子源的 Ultivo LC/TQ对测量的两种杂质显示出优异的灵敏度。3-氨基吡啶可准确定量为 5 ng/mL， 异烟酰胺在4-氨基吡啶基质(20 mg/mL)中最低可定量为 0.5 ng/mL。该分析方法对每种分析物的精度都很高，在定量限下进行的六次重复进样中，3-氨基吡啶和异烟酰胺的RSD%分别为4.25%和0.23%(图3)。分析结果观察到极好的线性，6点校准曲线中两种杂质的R²均大于0.99(图2)。 图2.在API 基质中测定的3-氨基吡啶和异烟酰胺的6点标准曲线，在定量限下进行六次重复进样的叠加图 使用混合模式采集功能为分析获得更多信息 混合模式采集允许MS用户同时采集扫描数据和 MRM 数据，操作人员可能在同一样品中发现其他洗脱化合物。针对目标化合物的 MRM 提供了比扫描数据更具选择性、更灵敏且更精确的定量。扫描数据可以提供样品中存在的意外分析物的信息。DAD 模块也可以很容易地集成到液相色谱堆栈中，可提供额外优势，可以检测到高浓度 API， 从而及时将流向质谱仪的液相流转移到废液中(图3)。使用混合模式扫描不会改变 MRM 离子对的峰形或面积(图4)。 图3.混合模式采集功能可以同时使用扫描和 MRM。 DAD信号可以检测API，从而及时将液相流转移到废液中，降低MS 污染。 DAD 信号未检出 MS发现的杂质 本应用简报证明了在所研究的 API中，即 20 mg/mL4-氨基吡啶中潜在致突变性杂质(3-氨基吡啶和异烟酰胺)灵敏、准确的定量。包含 MRM 的混合模式采集(Agilent Ultivo 的特有功能)允许从样品中采集额外的扫描信息，并可在同一时间段内用 MRM 准确定量 PMI 化合物。由于Ultivo 具有与 Agilent 1260 Infinity lI Prime液沐色谱系统联用的标准 ESI 离子源的优异性能，因此建议使用这种经济的仪器组合，在保持潜在杂质准确定量的同时，使用少量API样品检测 PMI. ( 参考文献 ) 1. ( US D epartment of Health andHuman Services； FDA； CDER； CBER.M7(R1) A ssessment and Control ofDNA Reactive (Mutagenic) Impurities in Pharmaceuticals to L i m it P o tential Carcinogenic Risk. ICH， March 2018.2 ) ( 2. Jain， M. et al.Determination ofFive Potential Genotoxic I mpuritiesin Dalfampridine Using Liquid Chromatography. J. Pharm.Biomed. Anal. 2016， 133，27-31 ) 图4.使用混合模式和仅使用 MRM 扫描类型时，可以观察到几乎相同的峰形和峰面积 3. Covert， K. How to Catch a Potential Mutagenic Impurity ( Using an Agilent LC/MSD XT andAgilent I nfinityLab Poroshell 1 20 HILIC-Z Column for Sensitive and Reliable Detection of Dalfampridine Impurities (如何使用安捷伦 LC/MSD XT 和 Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z 色谱柱采集潜在致突变 性杂质，实现灵敏而可靠的达伐吡啶 杂质检测)，安捷伦科技公司应用简 ) 报，出版号5994-0864EN，2019 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 C安捷伦科技(中国)有限公司， 2019 ( 2019年8月19日，中国出版 5994-1238ZHCN ) 本应用重点介绍了一种分析方法，用于精确定量两种潜在致突变性杂质 3-氨基吡啶和异烟酰胺，这两种杂质可由达伐吡啶中的活性药物成分 (API) 4-氨基吡啶形成。Agilent Ultivo LC/TQ 具有混合模式采集功能，通过该功能可以同时采集样品的定量（SIM 和 MRM）及定性信息（全扫描和产物离子扫描）。混合模式的工作原理是将扫描功能与目标分析物的 SIM 或 MRM 整合到同一时间段内。实验表明该方法具有优异的灵敏度和精度，潜在致突变性杂质的定量限远低于法规要求。