原料药中脱酰胺胰岛素检测方案(液相色谱仪)

作者 Susanne Stephan 和 Sonja Krieger 安捷伦科技有限公司 Waldbronn， Germany 用于药物杂质分析的高分辨率采样二维液相色谱 隐藏在 API 峰下的相对浓度杂质的检测 应用简报 小分子药物与仿制药 摘要 分析与活性药物成分(API)有关的低浓度杂质对原料药的质量控制来说至关重要。当杂质与 API 的化学结构相似且浓度差异较大时，色谱分离与检测将变得困难。 Agilent 1290 Infinity Il二维液相色谱解决方案可实现全二维液相色谱(LC×LC)、多中心切割二维液相色谱(MHC)以及高分辨率采样二维液相色谱(HiRes 2D-LC) 之间的轻松切换。在本应用简报中，使用高分辨率采样二维液相色谱实现两种紧邻洗脱的化合物的分离，其中一种化合物浓度极低且隐藏在其他高浓度化合物峰下。以氯二氟苯甲酸和脱酰胺胰岛素分别作为标准物质和实际样品进行分析。 Agilent Technologies 前言 原料药的纯度分析对于药物质量和患者安全来说都非常重要。根据ICH 指南 Q3A(R2)， 应对新原料药中含量大于0.05%阈值(相对于API) 的杂质进行报告。对这些浓度下的杂质进行分离和检测具有极大的挑战性，尤其当杂质结构与活性药物成分(API)具有相似性时。 本应用简报以相对浓度为100%及0.05%的氯二氟苯甲酸的不同异构体为例，展示了高分辨率(HiRes) 采样二维液相色谱在杂质分离与检测中的应用。使用 Agilent 1290 Infinity ll高动态范围二极管管阵检测器(HDR-DAD) 杂质分析仪解决方案作为二维检测器可以进一步提高本应用的精度和准确度。o .以脱酰胺胰岛素作为实际样品分析，以展示高分辨率采样2D-LC/MS 对具有相似结构的杂质的检测。此处，二维液相色谱还具备其他优势，即第二维分离可作为脱盐步骤，避免第一维缓冲液中的高盐含量进入MS离子源造成离子抑制。使用Agilent MassHunter 的第二维色谱图生成器查看并分析 MassHunter 中的2D-LC/MS 数据。 在高分辨率采样二维液相色谱中，在选定时间范围内收集几个涵盖第一维色谱图中整个峰面积范围的小体积馏分，以此测定目标化合物，如图1所示。每次切割都驻留在采样环中，并在第二维中对所有切割进行连续分析。这一模式可确保所有选定化合物均转移至第二维，并在其中得到分析。这样，选定的共洗脱化合物都经过高分辨率采样处理，以在第二维中进行分析。如技术概述4所示，这一操作可实现可靠的定量分析。 实验部分 ( 设备 ) Agilent 1290 Infinity Ⅱl二维液相色谱解决方案包括以下模块： ( 两台 Agilent 1290 Infinity lI 高速 泵(G7120A) ) ( Agilent 1 290 Infinity lI Multisampler (G7167B)， 配备 Infinity Ⅱ样品冷却装置(选件 #100) ) ( 两台 Agilent 1290 Infinity l高容 量柱温箱(G7116B) ) ( 三台 Agilent 1290 Infinity l l二极 管阵车检测器 (G7117B)， 配备 3.7 mm、10mm、60 mm 最大光 强卡套式流通池 (G4212-60008) ) ( Agilent 1290 Infinity 阀驱动 (G1170A)和2位/4通双向阀 (二维液相色谱阀头， G4236A) ) ( 两个 Agilent 1290 Infinity 阀驱动(G1170A)，配备带40 pL定量不的多中心切心阀 (G4242-64000) ) 切割次数123456 图1.高分辨率采样二维液相色谱示意图 为分析脱酰胺胰岛素，将 Agilent 1290Infinity Ⅱ二维液相色谱解决方案与配备安捷伦双喷射流 ESI 离子源的 Agilent6545 Q-TOF 联用。为避免第一维缓冲液中的高含量盐进入离子源，按之前应用简报'中的建议，使用时间表进行 MS分流阀切换，在每次第二维分析的第一分钟将液流引入废液。 ( 软件 ) ( 带安捷伦二维液相色谱软件(产 品版本 A.01.03[025]) 和 Agilent HDR-DAD ChemStation 插 件 (产 品版本 A.01.01[015]) 的 AgilentOpenLAB CDS ChemStation 修订 版 C.01.07 SR2 [255] ) ( Agilent MassHunter 工作站 LC/MS 数据采集软件，版本 B.08.00， Build 8.00.8026.0 ) ( Agilent MassHunter 工作站定性 分析软件，版本 B.07.00， Build 7.0.7024.0 ) ( 用于 MassHunter 的安捷伦第二维色谱图生成器，修订版1.0.15 ) 化学品 所有试剂纯度均为液相色谱级。乙腈和硫酸钠购自 Merck (Darmstadt，Germany)。甲酸、磷酸、磷酸氢二钠以及磷酸二氢铵购自 Sigma-Aldrich(Steinheim， Germany)。新制超纯水来自配置 0.22 pm 膜式终端过滤器(Millipak) 的 Milli-QIntegral 水纯化系统 (Millipak， EMD Millipore，Billerica， MA， USA)。5-氯-2，4-二氟苯甲酸、3-氯-2，4-二氟苯甲酸、2-氯-4，5-二氟苯甲酸以及牛胰腺胰岛素标准品均购自Sigma-Aldrich(Steinheim，Germany)。 样品 用50/50的水/乙腈配制浓度为1 mg/mL 的氯二氟苯甲酸储备液。用这些储备液配制不同浓度比的三种化合物的混合物。 pH 为2.55时，将浓度为 1 mg/mL的胰岛素溶于25 mmol/L 的磷酸钠缓冲液中。为使胰岛素脱酰胺基化，将胰岛素溶液的 pH值调为9，并在室温下放置12个小时。 高分辨率采样二维液相色谱分析氯二氟苯甲酸的方法 高分辨率采样 2D-LC/MS分析脱酰胺胰岛素的方法卡(修改自))3 切割次数 10 MS分流阀时间表 时间间隔编号开始时间(min) 分流阀位置 时间间隔编号开始时间(min) 分流阀位置 1 0 MS 13 42.02 MS 2 16.02 废液 14 46.02 废液 3 17.02 MS 15 47.02 MS 4 21.02 废液 16 51.02 废液 5 22.02 MS 17 52.02 MS 6 26.02 废液 18 56.02 废液 7 27.02 MS 19 57.02 MS 8 31.02 废液 20 61.02 废液 9 32.02 MS 21 62.02 MS 10 36.02 废液 22 66.02 废液 11 37.02 MS 23 67.02 MS 12 41.02 废液 高分辨率采样二维液相色谱的方法设置通过 Agilent 1290 Infinity Ⅱl二维液相色谱解决方案执行高分辨率采样二维液相色谱。阀配置(图2)包括与带有12个定量环的多中心切割阀相连的2位/4通双向阀。采用这一设置后，最多可对10次连续切割进行采样与储存以待分析。对于高分辨率采样二维液相色谱，为避免发生样品损失，建议最大定量环充填量为80%。图3显示了用于氯二氟苯甲酸分析的第二维泵方法设置。首先，运行一维液相色谱分离样品，并将色谱图加载为预览窗口中的参比信号。将高分辨率采样设置为基于时间，以目标峰为依据，氯二氟苯甲酸的九次切割涵盖了整个峰宽。在给定的一维条件下，7秒的采样时间相当于58%的定量环填充。 Agilent 1290 Infinity lI HDR-DAD 杂分分析仪解决方案采用的进样量更大，第二维检测器需要10次切割以及9s的采样时间才能覆盖整个第一维峰宽。因此，最终定量环填充量为75%。对于脱酰胺胰岛素的高分辨率采样，按照相同程序进行方法设置。采用十次切割且采样时间为4秒时，相当于50%的定量环填充。 图2.带12个采样环的 Agilent 1290 Infinity II 二维液相色谱解决方案的阀配置 结果与讨论 氯二氟苯甲酸分析 首先使用高分辨率采样二维液相色谱对三种异构体2-氯-4，5-二氟苯甲酸(化合物1)、5-氯-2，4-二氟苯甲酸(化合物2)以及3-氯-2，4-二氟苯甲酸(化合物3，结构见图4)不同浓度比的混合物进行分析，以配备10mm最大大强卡套式流通池的 Agilent 1290 Infinity II DAD 作为第二维检测器。 图5显示了两种混合物的第一维色谱图，分别为三种化合物以相同的低浓度混合时得到的混合物色谱图(蓝色)，以及化合物3、化合物2和化合物1分别以100%、0.05%、0.05%的相对浓度混合时得到的混合物色谱图(红色)。在蓝色色谱图中，可以观察到三个相互分离的峰，然而在红色色谱图中，化合物2(相对浓度为0.05%)隐藏在化合物3(相对浓度为100%)之下，无法作为分离的峰进行检测。在这些化合物的二维液相色谱分析中，使用高分辨率采样对峰3的整个峰宽进行采样，随后在第二维色谱柱上对九次切割进行连续分析。图6显示了对第一维峰的采样方案以及生成的切割2-5的第二维色谱 图6.化合物3的第一维色谱图(顶部)，对整个峰宽进行切割1-9采样。对切割2、3、4、5进行分析得到的第二维色谱图 为了根据ICH 指南给出的报告阈值确定本方法的可用性，配制了三种氯二氟苯甲酸的不同混合物，包含相对浓度为100%的化合物3与相对浓度为0.05%、0.10%或0.15%的化合物1和2。如图7所示，使用Chemstation 的二维液相色谱查看器计算所有切割中化合物3(3-氯-2，4-二氟苯甲酸)与化合物2(5-氯-2，4-二氟苯甲酸)各自的第二维峰面积 总和。每种混合物重复分析六次。表2显示了三种不同混合物的平均峰面积以及相对标准偏差(RSD)。混合物1、2、3中浓度较低的化合物2的峰平均信噪比(S/N) 分别为 3.2、5.9与12.2，这些值位于或低于定量限(LOQ)范围。这也解释了化合物2峰积分的 RSD高达7.95%的原因。检测到化合物2与化合物3的峰面积之比分别为0.03%、0.07%以 及0.14%。鉴于两种化合物第一维运行时测定的响应因子为1.17，计算得到的准确度值为71.6-108.5%， 考虑到主要化合物与杂质间的浓度差异较大，这已经是一个良好的结果。这一结果表明，根据ICH 指南Q3A(R2)给出的相对浓度报告阈值(0.05%)，使用高分辨率采样二维液相色谱可以实现API中杂质(杂质在第一维中与主峰共洗脱)的分离与检测。 图7. Chemstation 二维液相色谱查看器中显示的氯二氟苯甲酸高分辨率采样二维液相色谱分析结果，其中包括化合物2(5-氯-2，4-二氟苯甲酸)与化合物3(3-氯-2，4-二氟苯甲酸)的峰面积 表2.使用配备10mm 最大光强卡套式流通池的 Agilent 1290 Infinity II DAD 作为第二维检测器，根据连续六次运行的结果所计算的三个不同混合物的平均峰面积与相对标准偏差。化合物2与化合物3的峰面积比以%表示。为了计算准确度，将根据第一维峰计算得到的响应因子1.17考虑在内 3-氯-2，4- 5-氯-2，4- 二氟苯甲酸 二氟苯甲酸 (化合物3) (化合物2) 峰面积 RSD (%) 峰面积FRSD (%) S/N 峰面积比(%) 准确度(%) 混合物1 (0.05：0.05：100%) 10685.64 0.26 3.39 7.95 3.2 0.03 71.6 混合物2(0.10：0.10：100%) 10616.72 0.39 7.47 3.22 5.9 0.07 82.3 混合物3 (0.15：0.15：100%) )110548.79 0.13 14.67 2.71 12.2 0.14 108.5 为了进一步提升精度和准确度，使用Agilent 1290 Infinity lI HDR-DAD 杂质分析仪解决方案作为第二维检测器。该解决方案将两台配备不同光程最大光强卡套式流通池的二极管阵列检测器的信号相结合以增加紫外动态线性范围。这样，化合物3可以有更大的进样量且不会超出紫外线性范围。混合物1-3的平均信噪比均高于 LOQ，分别为20.7、24.1与34.0。化合物2的峰面积精度得到了极大的改善，同时 RSD 值低于 1.58%(表3)。准确度范围为96.4-108.5%，证明定量分析结果非常出色。 脱酰胺胰岛素分析 在碱性条件下牛胰腺胰岛素脱酰胺基化，生成含杂质的药物相关物质的实际样品。使用高分辨率采样2D-LC/MS对该样品进行分析。使用 MassHunter的第二维色谱图生成器将 Agilent OpenLAB CDS ChemStation 版的测量数据与 MassHunter 进行结合。该软件通过获得的所有第二维 MS 数据生成第二维色谱图，且第一维中每次切割生成一个色谱图。这些色谱图将显示在 MassHunter 中， 与 OpenLAB CDS 表3.以Agilent 1290 Infinity II HDR-DAD杂质分析仪解决方案作为第二维检测器，根据连续六次运行的结果所计算的三个不同混合物的平均峰面积与相对标准偏差。化合物2与化合物3的峰面积比以%表示。为了计算准确度，将根据第一维峰计算得到的响应因子1.17考虑在内 3-氯-2，4- 5-氯-2，4- 二氟苯甲酸 (化合物3) 二氟苯甲酸 (化合物2) 峰面积 RSD(%) 峰面积 RSD (%) S/N 峰面积比(%) 准确度(%) 混合物1 50072.70 1.19 23.30 1.58 20.7 0.05 108.5 (0.05：0.05：100%) 混合物2 49020.63 0.85 42.02 1.44 24.1 0.09 99.9 (0.10：0.10：100%) 混合物3(0.15：0.15：100%) 48698.74 1.34 60.37 1.47 34.0 0.12 96.4 图 8. Agilent MassHunter 中显示的脱沐胺胰岛素分析的信号。A)第一维UV信号，使用高分辨率采样进行切割采样B)整个第二维 MS 信号C) 整个第二维 UV信号 ChemStation 版中二维液相色谱查看器所提供的相似。如图8A 所示，通过指示切割的信号的富集，第一维紫外色谱图可在 MassHunter 中显示。图8B展示了整个2D-MS信号，图 8C展示了 MassHunter 中整个 2D-UV 信号。使用 MassHunter 的第二维色谱图生成器可为10次切割分别创建单独的色谱图。图9中以层叠方式显示了10次切割的总离子流色谱图(TIC)。 在每次第二维分离的第一分钟内，通过 切换 MS分流阀使液体流入废液。洗脱馏分中所含缓冲盐即以这种方式排除在 MS 离子源之外。对于图9中的每个 TIC，在运行时间为1分钟时，可以看到一个台阶，此时将分流阀切换回来，液体将流入 MS。切割2-10中保留时间为2.06分钟时，可以观察到不同强度的胰岛素主峰。第二维梯度包括一个较短的过程，即用90%B冲洗色谱柱，这导致在接近3.2分钟时基线快速升高然后降低。图10 显示了 切割7的TIC 和相应的第二维紫外信号的放大视图，该切割在第一维胰岛素主峰拖尾处进行采集。在第二维色谱图的MS 和 UV 信号中均观察到了两个峰。图11为提取出的两个峰的质谱图。峰1的同位素模式可看作胰岛素的[M+5H]5+离子。峰2的质谱图显示了对应于一种胰岛素的单一脱酰胺产物的同位素模式(中性质量数转移为0.98 Da)。切割6中可以检测到相同化合物(相关数据未显示)。 图10.切割7的第二维色谱图，由 MS (TIC) 和紫外信号 (DAD2) 生成 图11.切割7的第二维色谱图中观察到的峰1与峰2的质谱图 结论 本应用简报展示了使用高分辨率采样二维液相色谱对样品中与主要化合物具有相似结构的低浓度杂质的检测。根据 ICH指南对新原料药中杂质的相关规定，使用氯二氟苯甲酸的混合物进行测试，结果显示相对浓度为 0.05%、0.10%、0.15%和100%且在第一维分析中无法单独检测到的化合物，可通过高分辨率采样二维液相色谱转移至第二维色谱柱并进行分离。检测到的化合物5-氯-2，4二氟苯甲酸的准确度值为71.6-108.5%。峰面积精度为2.71-7.95%。以 Agilent 1290 InfinityII HDR-DAD 杂质分析仪解决方案作为第二维检测器可以增加进样量，同时可以改善准确度 (96.4-108.5%)和峰面积精度(1.44-1.58%)。以脱酰胺胰岛素作为实际样品，使用高分辨率采样2D-LC/MS 进行分析。使用 AgilentMassHunter 的第二维色谱图生成器评估数据。在两次切割中通过对应的同位素模式检测并鉴定了胰岛素的单一脱酰胺产物，两次切割均在第一维胰岛素主峰拖尾处进行采集。 ( 参考文献 ) ( 1. 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