血清中睾酮检测方案(液相色谱仪)

使用液夜色谱/三重四极杆 MS/MS联用系统分析血清中的睾酮 应用简报 作者 摘要 M.P. George 安捷伦科技公司 将 Agilent 1200 系列快速分离液相色谱 (RRLC)系统与大气压化学电离 (APCI)模式的Agilent 6430 三重四极杆LC/MS联用，开发出可快速定量分析血清中总睾酮的方法。其中使用了二维液相色谱法，使基质干扰和离子抑制效应降至最低，同时缩短了分析时间。 Santa Clara， CA USA Andre Szczesniewski 安捷伦科技公司 Schaumburg， IL USA 结果表明该方法在5至2000 ng/dL 范围内具有良好的定量线性(R²>0.99)，分析时间仅为4.5分钟，日间精度(相对标准偏差)低于10%。在5%牛血清白蛋白中，检测限(LOD) 和定量限(LOQ)分别为 2 ng/dL 和5 ng/dL. 本临床研究应用简报仅限研究使用。 不可用于诊断目的。 Agilent Technologies 睾酮在人体内同时发挥合成代谢和雄激素效应。其合成代谢作用的益处包括增加肌肉质量和力量，提高骨密度和强度，以及刺激线性生长和骨骼成熟。 本应用简报采用 Agilent 6430 三重四极杆LC/MS系统，以二维中心切割液相色谱和 APCI MS 模式， 建立了一种可快速、灵敏、精确测定血清中总睾酮的方法。二维中心切割液相色谱可降低基质效应和离子抑制效应，在大量血清样品中均未观察到任何干扰，同时还缩短了临床研究中所需的分析时间。 实验部分 试剂和标样 以甲醇(赛默飞世尔科技)配制睾酮和d3代睾酮(分别购自西格玛奥德里奇公司和 Medical Isotopes 公司)的储备溶液，浓度为 10 ug/mL， 并储存于5℃以下。以5%牛血清白蛋白稀释这些储备溶液得到校正标准溶液，浓度分别为5、10、100、500、1000和2000 ng/dL。 仪器 本方法是基于 Agilent 1200 系列快速分离液相色谱(RRLC) 系统充配有 APCI 源的Agilent 6430 三重四极杆 LC/MS联用系统开发的。仪器条件在表1中列出。 样品制备 采用沉淀法制备血清样品： 1.向每个内含 0.1 mL 血清的试管中加入0.1 mL工作内标(d3代睾酮)，浓度为100 ng/dL 的乙腈水溶液 2.向每根试管中加入0.4 mL乙腈 3.接着将样品在 3000 rpm 下离心 10分钟 4.将每个样品的上清液转移至第二根试管中 5.在50°℃下蒸干溶剂(持续约10分钟) ( 6.向每根试管中加入 0.1 mL 水：甲醇 (50：50)溶液，涡旋振荡 ) 表1.液相色谱和质谱条件 自动进样器温度 6°C 分析色谱柱： ZORBAX Eclipse Plus C-18色谱柱， 2.1×50mm，1.8 um粒径(部件号 959741-902) 针头清洗 冲洗孔(50：25：25， 异丙醇：甲醇：水，5秒) 流动相 A=水+0.1%甲酸 B=甲酒+0.1%甲酸 分析时间 4.5 min 流速 0.5 mL/min 梯度泵 泵1(上样) 泵2(分析) 时间 (min) %B 时间 (min) %B 0.0 45 0.0 45 1.5 45 1.7 45 2.2 80 1.9 80 3.2 80 3.0 80 3.5 45 3.7 45 4.0 45 色谱柱阀切换时间 时间 (min) 位置 0.0 1 0.9 2 2.2 1 离子模式 正模式， APCI 干燥气温度 300°C 气化温度 300°C 干燥气体流速 4 L/min 雾化器压力 20 psi 毛细管电压 4500 V 电晕电流，正模式 2pA MRM 采集 Q1和Q2峰宽分别为 1.4 m/z 和0.7m/z 质谱条件 离子模式 正模式， APCI 采用二维液相色谱法执行中心切割，其中上样色谱柱位于分析色谱柱之前。泵1通过自动液体进样器(ALS)将样品载入 C-8上样色谱柱中，阀位于位置1(图1A)。上样色谱柱将睾酮从众多潜在的干扰物质中分离出来。在将睾酮从上样色谱柱中洗脱之前，将阀切换至位置2，然后利用C-18分析柱使睾酮与干扰物质进一步分离(图1B)。在将睾酮峰载入分析色谱柱后，将阀切换回位置1(图1C)。上样色谱柱中的所有剩余成分均洗脱入废液中，在色谱柱平衡后载入下一个样品。分析柱中的睾酮在洗脱后进入三重四极杆LC/MS， 然后平衡色谱柱准备进行下一次分析。流动相、各台泵的梯度以及阀位置切换时间如表1中所示。 分析参数 睾酮及气代内标 (IS)的分析参数如表2中所示。 图1.睾酮二维中心切割分析的阀配置。该色谱方法的配置中包括两台泵、 一个切换阀以及两根色谱柱，可从干扰物质中快速、高效地分离睾酮。上样色谱柱用于第一维分离，分析色谱柱用于第二维分离 A.)首次样品上样 B.)首次样品分析 C.)后续样品上样和分析 A. 首次样品上样 阀位置1 上样色谱柱：进行复杂样品进样，并将未保留的化合物洗脱至废液 分析柱：已平衡，准备进行分析 阀位置2上样色谱柱：将较早洗脱出的污染物洗脱至废液 分析柱：从上样色谱柱获得目标化合物(睾酮) C.后续样品上样和分析 阀位置1 上样色谱柱：将剩余组分洗脱至废液，然后进行平衡并载入下一个样品 分析柱：洗脱目标化合物(睾酮)进入质谱，然后进行平衡并准备执行下一次分析 表2.MS/MS分析参数 化合物 保留时间 (min) MRM 离子对 碎裂电压 驻留时间 (ms) 碰撞能量(EV) 睾酮 3.11 289.2>109 155 250 30 289.2>97 内标睾酮-d3 3.10 292.2>97 155 250 30 结果与讨论 在干扰和基质效应最小化条件下分析睾酮 二维中心切割液相色谱 中心切割配置中采用两根色谱柱，可降低基质效应和离子抑制效应，同时缩短了分析时间。在睾酮峰从上样色谱柱(第一维)中洗脱后，洗脱时间的中心点临近之前，阀将切换至分析柱。睾酮峰在分析色谱柱(第二维)中进一步分离以去除剩余的干扰物质(图1)。最终可得到一张非常清晰的色谱图，其中只有睾酮一种主要成分(图2)。 图2.含有睾酮和内标(浓度均为100 ng/dL)的代表性血清样品的提取离子色谱图。图中展示了内标 (IS)(97m/z)、定量离子(97m/z) 和定性离子(109 m/z)的叠加图 定量精确度及重现性 在5%牛血清白蛋白中加入浓度分别为5、10、100、500、1000 和 2000 ng/dL 的睾酮，每个浓度平行测定三次，以建立睾酮的校准曲线。图3中展示出该方法在宽动态范围(2.4个数量级)内具有良好的线性，R?值为0.999。检测限(LOD) 和定量限 (LOQ) 分别为 2 ng/dL 和 5 ng/dL。 LOD 定义为对一组五个独立样品进行分 析，每个样品平行分析三次，五个测得值的信噪比皆大于等于10时睾酮的最低可检测浓度。LOQ定义为对一组五个独立样品进行分析，每个样品平行分析三次，五个所测值均在目标浓度±20%范围内的最低可检测睾酮浓度。校正标准品的定量日间(组间)变异系数 (CV)结果良好，最低为0.7%， 不超过10%(表3)。 表3.组间定量精度(变异系数) 浓度 (ng/dL) 变异系数(%) 5 9.2 10 7.3 100 3.1 1000 0.7 可在5到2000 ng/dl 范围内精确定量睾酮 图3.正常血清中睾酮的校正曲线。用于定量的离子对为289>97 使用一组50个血清样品进行方法验证，之前已采用其它 LC/MS/MS 程序对这些样品进行了定量。该方法与参比实验室方法的定量相关性良好，R²值为0.978(图4)， 且所有50个样品中均未观测到任何干扰。需要注意的是该应用简报中描述的方法并不能作为诊断方法进行睾酮测试。使用血清样品进行方法验证后，证实了该方法具有优越的睾酮检测和定量性能。 与参比实验室方法具有良好的相关性 图4.安捷伦方法与参比实验室方法测得的50个血清样品中睾酮水平的相关性 结论 本文中使用二维中心切割液相色谱与三重四极杆LC/MS联用系统，开发并验证了一个准确、可重现且动态范围相当宽的血清中睾酮的检测方法。检测限为 2 ng/dL，定量限为 5 ng/dL。二维中心切割液相色谱可使基质干扰和离子抑制效应降至最低，这类效应主要由血清中存在的脂质和其他生物化合物引起。分析时间小于5分钟。 致谢 作者非常感谢明尼苏达州罗彻斯特市梅约诊所的 Frank Crow、 David Barnidge 和Ravinder Singh 在物资方面所提供的帮助，为我们提供了50例血清样品用于方法验证。 ( 参考文献 ) ( 1 . S . Bolour and G. B raunstein， "Testosterone Therapy in Women： A R eview，" Int J Impot Res. 17：399 - 408，2005. ) www.agilent.com/chem/qqq 本文仅限研究使用。不可用作诊断方法。本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 安捷伦科技公司对本文中出现的错误或由于提供、展示或使用本文所造成的间接损失不承担任何责任。 c安捷伦科技(中国)有限公司，2010 中国出版，2010年3月30日 5990-5228CHCN Agilent Technologies 将 Agilent 1200 系列快速分离液相色谱 (RRLC) 系统与大气压化学电离 (APCI) 模式的 Agilent 6430 三重四极杆 LC/MS 联用，开发出可快速定量分析血清中总睾酮的方法。其中使用了二维液相色谱法，使基质干扰和离子抑制效应降至最低，同时缩短了分析时间。结果表明该方法在 5 至 2000 ng/dL 范围内具有良好的定量线性 (R2 > 0.99)，分析时间仅为 4.5 分钟，日间精度（相对标准偏差）低于 10%。在 5% 牛血清白蛋白中，检测限(LOD) 和定量限 (LOQ) 分别为 2 ng/dL 和 5 ng/dL。