合成多肽药物中三氟乙酸残留物分析检测方案(离子色谱仪)

合成多肽药物中三氟乙酸残留物分析 陈磊1，马明扬2 1.深圳翰宇药业有限公司，深圳518057; 2.瑞士万通中国有限公司技术支援中心, 广州510070 摘 要：三氟乙酸常用于多肽的合成、纯化过程，多肽药物中三氟乙酸含量是一项重要的监测指标。本文建立了离子色谱法测定合成多肽药物中三氟乙酸残留含量的方法，获得了满意的结果。本法还可同时测定合成多肽药物中乙酸根、氯离子、磷酸根、硫酸根等无机阴离子。 关键词：离子色谱；三氟乙酸；合成多肽 1. 前言 三氟乙酸（TFA）常用于多肽药物化学合成中，TFA也用于固相树脂洗脱出粗肽的反相高效液相色谱纯化［1～5］。TFA在多肽药物中具有双重作用。一方面，它具有较强的酸性，与多肽药物结合可提高多肽药物的溶解度，并可提高多肽药物的稳定性；另一方面，TFA属于酸性有机溶剂，在药典中属于四类溶剂，临床使用中存在毒性，因此在多肽药物中又不能存在过多。所以，必须严格控制多肽药物中TFA。药典对四类溶剂尚无明确规定，通常按三类溶剂的限度0.5%限定。因此，TFA含量测定是合成多肽药物的一项重要检测项目。同时由于TFA与多肽的结合很稳定，无论是冻干或旋蒸都无法将其去除，所以转盐过程中TFA残留和盐含量监测极其重要。TFA的测定可以用气相色谱-质谱联用[6-7]，但样品处理麻烦、设备成本高。本文建立了离子色谱法测定合成多肽药物中TFA残留量的方法，该方法简单易行、结果准确、灵敏度高、设备成本低。本法还可同时测定合成多肽药物中乙酸根、氯离子、磷酸根、硫酸根等无机阴离子。 2. 实验部分 2.1 仪器及试剂 Metrohm Compact 792 型离子色谱仪（瑞士万通），Metrosep A Supp 5-250分析柱。 三氟乙酸：Sigma 色谱纯；Na2CO3：基准,天津市化学试剂研究所；NaHCO3：基准，天津市光复精细化工研究所；溶液均用电阻率大于18M超纯水配制。 2.2 色谱条件 色谱柱：Metrosep A SUPP 5-250 阴离子分析柱，Metrosep Supp4/5 Guard 保护柱；流动相：3.2 mmol/L Na2CO3/1.0 mmol/L NaHCO3；流速：0.7mL/min。进样体积：20μL， 2.3 样品制备 称取一定量的样品，用纯水稀释，定容，用0.45um滤头过滤，进入色谱仪检测。 2.4 标准曲线 三氟乙酸 Conc(mg/L) 4.687 9.374 11.718 23.435 46.871 93.742 Y=26.1565+2.9641X r =0.9998 Area 27.7 56.23 70.22 145 301.6 627.1 乙酸根 Conc(mg/L) 9.628 19.257 24.071 48.142 96.284 192.57 Y=-5.62972+9.05675X r =0.9993 Area 17.11 40.47 52.27 112.4 222.4 420.2 氯离子 Conc(mg/L) 1.293 2.587 3.234 6.467 12.934 25.868 Y=13.496+0.702752X r =0.9991 Area 29.12 58.87 73.86 156.4 331.5 725.8 磷酸根 Conc(mg/L) 3.866 7.731 9.664 19.327 38.655 77.31 Y=35.0801+2.51116X r =0.9993 Area 25.28 51.36 64.17 132.8 280.8 608.5 硫酸根 Conc(mg/L) 4.078 8.156 10.195 20.39 40.781 81.562 Y=37.1938+0.961095X r =0.9993 Area 70.49 141.5 176.1 365.5 773.6 1678 2.5 标准混合物色谱图 图1 标准溶液色谱图 3. 分析结果 样品制备液经0.45um滤膜过滤后进入色谱仪分析，峰面积工作曲线定量。 原料肽 1#（固体） 10.14mg1mL 三氟乙酸 醋酸根 氯离子 磷酸根 硫酸根 Area 77.147 419.317 3.078 27.925 47.736 Conc 12.741 189.6 0.783 5.260 4.154 % 0.126 1.87 0.008 0.052 0.041 原料肽 2#（固体） 3.22mg1mL Area 4.675 390.806 0.0752 2.811 0 Conc 2.000 176.7 0.677 2.107 0 % 0.06 5.49 0.02 0.07 0 原料肽 3#（液体） Area 31.844 1773.6 22.054 5.356 0 Conc 6.027 802.8 1.450 2.426 0 4. 结论 本文对离子色谱法测定合成多肽药物中的三氟乙酸的方法进行了探讨。测定表明，该方法简单易行，专属性强，结果准确，灵敏度高，适合药物生产监控。并且在测定三氟乙酸的同时，也可测定其它残留成份：乙酸根、磷酸根、氯离子，硫酸根等。 参考文献 [1]　Geysen HM, Meloen RH, Barteling SJ. Use of peptide synthesis to probe viral antigens for epitopes to a resolution of a single amino acid. Proc Natl Acad Sci USA, 1984, 81: 3998 [2]　Houghten RA. General method for the rapid solid-phase synthesis of large number of peptides: specificity of antigen-antibody interaction at the level of individal amino acids. Proc Natl Acad Sci USA, 1985, 82:5131 [3]　Houghten RA, Pinilla C, Blondelle SE, et al. Generation and use of synthetic peptide combination libraries for basic research and drug discovery. Nature, 1991, 354:84 [4]　Fodor SPA, Read JL,Pirrung MC,et al. Light-directed spatially addressable parallel chemical synthesis. Science, 1991,251: 767 [5]　Echler J, Beyermann M, Bienrt M. Application of cellulose paper as support material in simultaneous solid-phase peptide synthesis. Collect Czech Chem Commun，1989, 54: 1746 [6] 色谱分析，分析化学手册 第四分册，化学工业出版社 [7] 张剑波, 胡建信, 曾铮, 朱燕, 地表水中微量三氟乙酸的分析方法. 分析化学. 2005.04（33）：549