左卡尼汀，左旋肉碱中药物中间体及成品分析检测方案(液相色谱柱)

LC Application Lab， Sanyofine ChinaNo.31.BDA International Business Park.2 Jing Yuan Street， BeijingEconomic Technological Development Zone，Beijing，China 100176 数据文件名：HILIC-2-70A-nado-007.lod Phone 400-801-3103 左卡尼汀中间体及成品的分析——PDA及NQAD检测器对比 客户提供已知结构中间体2和中间体3，以及成品左卡尼汀单标样品，希望能够建立中间体液相分析检测方法。由中间体结构式可知其紫外吸收较弱，因此首先使用二极管阵列检测器一-PDA， 对其紫外吸收进行确认。紫外吸收光谱图如图1和图2所示，二者均为短波长吸收，最大吸收波长分别为195 nm和194nm， 最终选择的紫外检测波长为195 nm。 OH 中间体2 中间体3 左卡尼汀 图1中间体2紫外吸收光谱图 图2中间体3紫外吸收光谱图 接下来进行液相方法的建立。考虑到中间体的极性较强，故首先使用具有超高表面极性的反相柱CAPCELLPAK ADME， 在100%水相条件下进行保留尝试，缓冲盐选择在低波长干扰较小的高氯酸钠体系。分析结果如图3所示，两中间体在反相系色谱柱上均无法得到保留，反相系色谱柱不适用于该项目分析。 图3 CAPCELL PAK ADME色谱柱分析结果 HPLC Conditions ： 色谱柱： CAPCELL PAK ADME S5； 4.6 mm i.d. ×250 mm (柱号：V45AD01312) 流动相：200mmol/L 高氯酸钠水溶液 流1.0mL/min 柱 ：) 30°C 进样量： 2uL 浓名 检PDA 195 nm 接下来，考虑利用阳离子交换模式和亲水性相互作用模式进行分析，以期得到良好保留和峰形。经过多方条件调整后，最终在亲水性相互作用色谱柱PC HILIC上得到良好保留结果，中间体分析谱图及放大图分别如图4-7所示。中间体在高氯酸钠体系下得到良好峰形，同时与死时间附近杂质峰取得了良好分离。应客户要求对其杂质进行了积分，积分表分别如表1-2所示(软件自动积分结果)。 图4中间体2分析结果 图5中间体2分析结果放大图 表1中间体2分析结果积分表 峰号 保留时间 面积 理论塔板数(USP) 分离度 拖尾因子 面积% (USP) 1 2.14 19989 6508 -- -- 0.476 2 2.241 12768 3218 0.77 -- 0.304 3 2.409 11463 5609 1.169 -- 0.273 4 2.489 6327 641 0.305 -- 0.151 5 2.594 14463 3830 0.375 -- 0.345 6 2.864 9457 4016 1.551 -- 0.225 7 3.231 14831 1041 1.262 -- 0.353 8 3.366 140601 10484 0.507 1.012 3.349 9 3.665 13954 7285 1.976 -- 0.332 10 3.84 1676 587 0.434 -- 0.04 11 4.032 3276 666 0.305 -- 0.078 12 4.184 4275 617 0.235 -- 0.102 13 4.384 1399 347 0.247 -- 0.033 14 4.533 1800 3187 0.237 -- 0.043 15 4.683 4327 1693 0.385 -- 0.103 16 5.375 3798 16380 2.222 -- 0.09 17 7.202 3933823 9549 7.895 1.331 93.702 总计 4198225 100 图6中间体3分析结果 图7中间体3分析结果放大图 表2中间体3分析结果积分表 峰号 保留时间 面积 理论塔板数(USP) 分离度 拖尾因子 面积% (USP) 1 2.132 20679 6685 0.494 2 2.236 14307 3445 0.813 0.342 3 2.401 11236 5230 1.152 0.268 4 2.586 13567 5117 1.336 0.324 5 2.86 10922 4366 1.726 0.261 6 3.184 10936 679 0.979 0.261 7 3.277 5987 1325 0.219 0.143 8 3.352 9779 56 0.07 0.234 9 3.468 9715 3932 0.115 0.232 10 3.658 17751 6082 0.932 0.424 11 3.934 6912 1238 0.868 0.165 12 4.117 14512 29 0.104 0.347 HPLC Conditions ： 色谱柱： PC HILIC S5； 4.6 mm i.d.×250 mm (柱号：322AD01250) 流动相： A： 200 mmol/L 高氯酸钠水溶液，以高氯酸调节 pH 为3.0B：乙腈 A/B=30/70 流1.0 mL / min速：柱 E 30°C 进样量： 5pL 浓各5mg/mL (流动相溶解) 检 PDA 195 nm 同时，我们也使用PC HILIC色谱柱进行了两中间体的共同分析，以期得到二者的基线分离结果，简化分析过程。然而在HILIC模式下，由于乙腈比例较高，且中间体自身需要在短波长下检测，因此可选的缓冲盐浓度及种类均有限；水相分别尝试使用0.1%磷酸溶液、20 mmol/L磷酸二氢钾溶液(磷酸调pH2.5)、20mmol/L磷酸二氢铵溶液(磷酸调pH2.5)及不同浓度高氯酸钠溶液，结果均无法得到两中间体的分离；且在盐浓度不足时，中间体由于自身的季铵盐结构易产生吸及作用，很难得到良好峰形，典型谱图如图8所示。 图80.1%磷酸条件PC HILIC分析结果 此外对柱温进行筛选，温度升高时保留时间有缩短趋势，但未见二者出现明显分离趋势，结果如图9所示。 图9不同柱温分析结果 考虑到中间体的整体紫外吸收较弱，应客户要求，使用高灵敏度气溶胶型检测器NQAD进行了分析对比。 由于气溶胶型检测器NQAD要求流动相必须为挥发性盐，因此将水相中的高氯酸钠更换为50 mmol/L甲酸铵溶液(+0.1%甲酸)进行分析，中间体2、中间体3、左卡尼汀共同分析结果如图10-12所示。由于5 mg/mL样品浓度较大， 在NQAD检测器上过载，出现信号平头峰或裂峰现象，把浓度稀释10倍后可得到正常峰形。但即使在大浓度样品分析中，未见死时间附近出现明显杂质峰，推测原因可能为杂质分子量较小，为挥发性杂质，无法在气溶胶型检测器上进行良好检出。此外，能够看到中间体在NQAD检测器上均出现多个明显色谱峰。 图10中间体2在NQAD检测器分析结果 图11中间体3在NQAD检测器分析结果 图12左卡尼汀在NQAD上分析结果 由于使用 NQAD进行检测时，中间体均出现溶出多个色谱峰现象，怀疑为中间体的成盐离子导致，因此在小浓度下进样 NaCI进行了排查，对比结果如图13所示。NaCI 保留时间和较大杂质峰保留时间一致，可能为相应对离子。此外，在 NQAD 系统使用的甲酸铵流动相体系下，中间体2和3得到了分离。 图13不同样品 NQAD 比较图 HPLC Conditions ： 色谱柱： PC HILIC S5； 4.6 mm i.d.×250mm 流动相： A： 50 mmol/L 甲酸铵溶液+0.1%甲酸 B： 乙青 A/B=30/70 流1.0 mL/min速：柱 30°C 进样量： 5pL 浓中间体5 mg/mL、0.5 mg/mL； 左卡尼汀3 mg/mL、0.3 mg/mL (以流动相溶解) 检 NQAD； EVA Temp： 35℃； NEB Temp： 30℃； Filter 2.5s 综上所述，使用大阪曹達 PC HILIC S5； 4.6 mm i.d. ×250 mm 色谱柱可完成左卡尼汀中间体及成品的保留，在紫外检测条件下获得较好峰形结果，能够与死时间附近的杂质峰取得良好分离；同时，在 NQAD检测器上，能够获得中间体的拆分结果(该流动相条件由于有机酸盐的掩盖作用，无法平移至紫外检测器进行分析)。 使用大曹三耀PC HILIC S5; 4.6 mm i.d. × 250 mm色谱柱可完成左卡尼汀中间体及成品的保留，在紫外检测条件下获得较好峰形结果，能够与死时间附近的杂质峰取得良好分离；同时，在NQAD检测器上，能够获得中间体的拆分结果（该流动相条件由于有机酸盐的掩盖作用，无法平移至紫外检测器进行分析）。