单克隆抗体中肽图分析检测方案(液相色谱仪)

快速 PTM 分析 作者 James Martosella， Alex Zhu 安捷伦科技有限公司 Wilmington， DE 19808 Ning Tang 安捷伦科技有限公司 Santa Clara， CA 95052 快速高效的单克隆抗体(mAb)肽图分析： UHPLC性能与表面多孔颗粒相结合 应用简报 生物制药 前言 反相色谱(RP)肽图分析是生物治疗药物分析中最主要的技术，可为生物制药产品提供全面的表征。当与质谱仪(MS)联用时，能实现对蛋白质及其变异体的鉴定，确定翻译后修饰(PTM)及其位点，并确认蛋白质序列。然而，由于蛋白质裂解物固有的复杂性，使得利用色谱进行肽图分析非常具有挑战性。因此，许多组织都致力于开发稳定、可靠的肽图分析方法。通常而言，肽图分析受到灵敏度低、峰形差及需要较长分离时间来达到所需分离度的影响。 近年来，人们应用超高效液相色谱 (UHPLC)以克服这些挑战，与常规HPLC相比，UHPLC 经证实具有超高分离度、更高的灵敏度，且可大大缩短分析时间。UHPLC 技术可更详尽地表征蛋白生物治疗药物，其通过加快流速、缩小粒径及缩短柱长，可在更短的分析时间内实现更高的分离性能。但是，这种类型的分离对压力要求越来越高，不能在常规的400和600 bar 高效液相色谱仪上进行操作，严重地限制了其应用范围。 为了解除这种限制，安捷伦引入一种2.7 um AdvanceBio 肽图分析色谱柱以弥补生物治疗药物表征中的关键缺陷，可在常规液相色谱系统压力下，实现快速而高效的肽图分析。采用表面多孔色谱填料， AdvanceBio 肽图分析色谱柱可在很短的分析时间和低系统压力下大大改善肽图分析，同时保持很高的峰性能和分析效率。本研究采用 AdvanceBio 肽图分析色谱柱，在较短的分析时间内对一种单克隆抗体(mAb)胰蛋白酶消化物进行 LC/MS肽图分析。此外还将 AdvanceBio 色谱柱及方法与一种亚 2 pm非安捷伦 UHPLC 肽图分析色谱柱进行性能比较。 材料与方法 样品前处理 首先将 50微升 mAb lgG1 (30 mg/mL) 与 75 pL100 mM 碳酸氢铵(pH8)混合。然后，在蛋白样品中加入75微升三氟乙醇及3pL200mM二硫代苏糖醇(DTT)， 60℃下加热1小时进行蛋白变性和还原。蛋白冷却至室温后， 加入 12 pL 200 mM 碘乙酰胺 (IAM).样品在室温黑暗条件下放置1小时。然后，加入3 pL DTT与过量的 IAM 反应1小时。样品用 900 pL水及 300 pL 100mM碳酸氢铵稀释。加入胰蛋白酶溶液 (75pL)， 37℃下孵育20小时。过夜孵育后，加入3pL纯甲酸以淬灭消化反应。 AdvanceBio 肽图分析色谱柱，2.1×100mm (部件号655750-902)， AdvanceBio 肽图分析色谱柱，2.1×150 mm(部件号653750-902)，非安捷伦 UHPLC 色谱谱，2.1×100 mm洗脱液：A：水+0.1%甲酸(体积比)B： 90%乙青+0.1%甲酸(体积比)进样量：15pL流速：多种温度：40°C检测器：UV， 215/220 nm仪器：Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统及 Agilent6530 精确质量四极杆飞行时间(Q-TOF) 质谱 四极杆飞行时间质谱参数 离子模式： 正 离子源： 安捷伦双喷射流 干燥气温度： 250 °C 干燥气流速： 10L/min 鞘气温度： 250°C 鞘气流速： 12 L/min 雾化器压力： 35 psi 毛细管电压： 3500V 裂解电压： 200 V 截取锥电压： 65V 八极杆1RF电压： 750 V 喷嘴电压： 0V 一级质谱质量范围(m/z)： 100到1600 二级质谱质量范围(m/z)： 100到1600 一级质谱扫描速率 (谱图数/秒)： 二级质谱扫描速率 (谱图数/秒)： 3 LC/MS 结果采用 Agilent MassHunter定性分析软件 B.06及Agilent MassHunter BioConfirm 软件 B.06进行分析。 快速肽图分析优化 优化肽图以分离及分析潜在的数百个色谱峰是一项重大任务。而在更短的分析时间内进行这些高分离度优化更具挑战性且消耗时间。采用长梯度分析 mAb 胰蛋白酶消化所得肽图，获得所需分离度需要120 min或更长，特别是对于 mAb 之类的大分子蛋白而言。虽然可采取更快的肽图分析，但是不能以牺牲分离度为代价，并且最终测试结果必须能提供与长时间分析同等水平的信息。 为了证实 AdvanceBio 肽图分析色谱柱的灵活性，即提高分析速度而不减损分离性能，图1中比较了两个UV分离。在此比较中，采用2.1×150 mm AdvanceBio 肽图分析色谱柱(上部色谱图)在75 min 内可实现 mAb 胰蛋白酶肽图优化，且在整个梯度范围内 肽图均可实实有效基线分离。75 min 分离很好地说明了此色谱柱在柱长为150mm(常规色谱柱长)的情况下具有极佳的分离性能，其肽图分析速度比过去同等尺寸条件的色谱柱快。但是，它还说明了该色谱柱具有极佳的灵活性，当梯度缩短时，可提高分析速度，同时不减损分离性能。 图1的下部为 14 min 的色谱图，色谱柱流速由0.2提高至0.6mL/min， 而柱长由150降低至100mm。改变的同时保持了体积流量，使每单位柱体积上的梯度变化相同，以确保相似的选择性。14 min 肽图详细说明了卓越的分离性能，在保持分离能力不变的同时，保持了基线分离及灵敏度。14 min 分离证实了UHPLC类型的速度和性能，而且在600 bar HPLC仪器条件下仍能实现这种快速分析。 图1. AdvanceBio 肽图分析色谱柱经优化可实现更快的肽图分析。梯度 10-40%B， DAD： 215nm， 40C。上图为 75 min 分离， 采用2.1×150 mm 色谱柱获得59个肽段峰(流速0.2mL/min， 211 bar)。，下图为优化后的14 min 分离， 采用 2.1×100 mm 色谱柱获得57个肽段峰(流速0.6 mL/min，433 bar) 采用AdvanceBio 肽图分析色谱柱进行 LC/MS肽图分析：陡峭梯度与长梯度的比较 在一个典型的生物制药肽图分析工作流程中，反相液相色谱通常与质谱检测联用。与更为常规的单 UV检测方法相比， RPLC/MS可显著提高肽图分析实验所得的信息量。RP LC/MS测量可区分共流出肽段，定位和鉴定肽段修饰，以及确定序列覆盖率。高序列覆盖率是胰蛋白酶消化物实现最佳分离的一个指标。 在 RP LC/MS分析中，通常采用长梯度以提高分离度，确保可在未修饰(天然)肽段以及整体消化物谱图中其他洗脱时间相近的肽段中检测出修饰(即即译后修饰或 PTM) 肽段。为了缩短分析 时间，常常使用陡峭的梯度，但是，这往往会降低分离度并损害整体肽图分析质量。因此，重要的是在缩短分析时间的同时，不应损害分离质量或丢失谱图信息。 图2比较了AdvancedBio 肽图分析色谱柱在40 min 和14 min 分析中所得的肽图分析总离子流图(TIC)。在该比较中，色谱柱尺寸不变，通过调整梯度斜率以保持不同色谱柱之间的梯度变化量/色谱柱体积相等，以确保色谱选择性相近。 TIC 比较说明了缩短豆析时间为 14 min 后， 分离度、选择性、分离性能并未受到影响，此外，流速的提高导致的压力增加较小，因此无需使用超过600 bar 的 UHPLC 仪器。 图 2.比较 Agilent AdvanceBio 肽图分析色谱柱总离子流图(TIC)， 展示色谱柱在 40 min 和 14 min 的 mAb胰蛋白酶消化物分析中的肽图分析性能。左图， 40 min 分析所得的 TIC (流速0.2mL/min， 140 bar)。右图， 14 min 分析所得的 TIC (流速0.6mL/min， 433 bar) 序列覆盖率。所有匹配肽段至少采集1张MS/MS 谱图以进行确认。40 min 和 14 min 分析在覆盖率方面基本没有变化。14 minLC/MS分析可得 99.63% mAb序列覆盖率， 而 40 min 分析可得99.84%覆盖率。该比较进一步确证了采用 AdvanceBio 肽图分析色谱柱，当缩短肽图分析时间时，并不会丢失肽段表征信息。 此外， 采用 MassHunter Qualitative Analysis 软件中的分子特征提取(MFE) 分别评价 40 min 和14 min 分析的序列覆盖率。MFE是一种算法，可在复杂分离数据(例如肽图)中寻找及提取一系列化合物。这一系列化合物然后与 mAb 蛋白序列进行匹配，计算序列覆盖率。图3显示了匹配肽段的提取化合物色谱图(ECC)及 采集时间(min) 图 3. Agilent AdvanceBio 肽图分析色谱柱分析所得的提取化合物色谱图(ECC)， 以比较 mAb 胰蛋白酶消化物分析结果。上图展示了40 min 分析所鉴定肽段的ECC， 所得 mAb 序列覆盖率为99.84%。下图展示了14 min 分析所鉴定肽段的 ECC， 所得 mAb 序列覆盖率为99.63% 脱酰胺基化会导致结构和功能发生变化，它是 mAb 发现、开发及生产过程需要监测的一个重要翻译后修饰。图4展示了一个实例，说明在 14 min 快速分析中如何监测和保留肽段脱酰胺基化，并与较长时间(40 min) 的分析进行比较。重链肽段357-366(其中包括 Asn 357) 在两种肽图分析分离中均得到鉴定。在上部及中间的ECC图中，天然肽段峰可与其两个脱酰胺基形式完全分离，在重叠 ECC 中显现为三个完全分离的色谱峰。与40min 分析(上部)比较， 14 min分析(下部)中的天然肽段峰及脱酰胺基开式也可很好地分离，且可通过QTOF分析轻松进行鉴定。 下图展现了天然肽段(母离子m/z=581.32)及两种脱酰胺基形式(母离子m/z=581.81) 的MS/MS图。在该谱图中，y和b系列碎片是主主离子，三种肽段的 y4-y8离子相同，但色谱峰2和3的b2和b3离子(圆圈标注)要高0.98 Da， 因此验证了它们是天然肽段的修饰形式。 自动化合物提取(MFE中)还可将肽段所属的所有类型离子的强度(同位素、电荷态、加合物等)汇总于表1中的Volume 项下。通过表1中的两个数据集可轻松得出修饰肽段的相对百分比。总体而言，与长时间分析相比， AdvanceBio 肽图分析色谱所得的快速 14 min 肽图并不会减损PTM(脱酰胺基化)信息或序列覆盖率。采用更陡峭的梯度并提高流速，色谱柱可保持卓越的分离性能，并提供可信度高的完整肽图表征。 ×106 图4.提取化合物色谱图 (ECC)的叠加，以及天然肽段及其脱酰胺基形式的 MS/MS谱图(下部)。上部图展示了40 min 分析的结果，中部图展示了 14 min分析的结果，：，下部图展示了天然肽段及以上显示的两种脱酰胺基形式的 MS/MS谱图 表1.提取化合物列表分别展示了40 min分析(上表) 和14 min 分析(下表)时天然肽段 HC (357-366)及其两种脱酰胺基形式的序列、修饰、保留时间、质量和卷积 40-min分析 AutomabtallyShow Colures 50 Automaticaly Show Colums 动 图 5owida. ni 755cqloco Saquence点 PradNods vo Pied Mods Vol 7 Sccre(Lio]T igo005-Agileit shorsiutpeSdi3 C057-2066 NOVDLTCLVK E357-396) NOSLTCLVK 7145 1100523 41019062 73.17 73748923 8119 NOVELTCLVX I*Dhamiantan09040160057 B357-396 NOVELTCLYK 7515 11C100G4 276957 70.5G 10C0333 5055 3 igo038 Agiem long rupptides in 20.d E357 386 N2VSLTCLVK rDearidnior4-00543167B357 22554 1181.60541 2747203 54.14 14-min分析 2047004 7151 陡峭梯度下的肽图分析： HPLC (AdvanceBio肽图分析色谱柱)与UHPLC (非安捷伦UHPLC 多肽分色色谱柱)的比较 利用 UHPLC 肽图分析的优势，分离性能显著提高，分析时间更短。采用亚 2 um 颗粒技术，在缩短分析时间的同时，还能大大提高肽段分离能力；这是小粒径颗粒降低扩散距离的结果。这种高分离度及高灵敏度在肽图分析中尤为重要，特别是检测修饰肽段时。与亚 2 um 色谱柱性能直接相比时，具有薄层多孔外壳及固体内核的2.7 um 表面多孔颗粒可提供超高的分离能力，同时由于色谱柱流速升高可降低背压限制。借助这种压力和速度的优势，无需使用超过 600 bar 的 UHPLC 仪器也能进行这种快速高效的肽图分析。 图5比较了lgG 胰蛋白酶消化物的UV色谱图，通过与业界顶尖性能的 UHPLC 肽图分析色谱柱的直接比较，展示了 AdvanceBio肽图分析色谱柱的高速度和高分离能力。上部色谱图表明，2.1×100mm AdvanceBio 肽图分析色谱柱经优化可实现快速高效的分析。在该分离中，肽段色谱峰在整个梯度范围内可实现良好分离，获得56个色谱峰，压力为 433 bar。在下部色谱图中，采用2.1×100 mm 的 UHPLC肽图分析色谱柱在相同色谱条件和色谱柱尺寸下进行分析。但是，肽图分析结果中需要重点强调的一点是 AdvanceBio 肽图分析色谱柱可在低压力下获得相同的分离结果。UHPLC 肽段分析色谱柱产生了700 bar 的背压，这需要使用UHPLC仪器，因此也就限制了其应用范围。 使用 LC/MS快速、常规且全面地进行 mAb 肽图分析有助于加快治疗药物开发流程的各个方面。但是，这些分离通常是在高压液相色谱系统上进行，以最大化效率及节约时间。表面多孔分离可提供高灵活性，可在 UHPLC/MS 或 HPLC/MS 仪器上使用，提供快速高效的分离。为了对比亚 2 pm UHPLC 及表面多孔 HPLC肽图分析色谱柱的 LC/MS 肽图分析性能及所需压力，我们直接比较了2.1×100 mm AdvanceBio 肽图分析色谱柱与相同尺寸的非安捷伦 UHPLC肽图分析色谱柱。图6展示了这两种色谱柱的RP LC/MS TIC 及 ECC 性能结果。同样的，所有鉴定出的肽段都采集了至少1张MS/MS 谱图以进行确认。 在TIC 及ECC比较中， 与非安捷伦 UHPLC 肽图分析色谱柱相比，AdvanceBio 肽图分析色谱柱LC/MS分析具有卓越的分离度及序列覆盖率。AdvanceBio 色谱柱的序列覆盖率为99.63%，而UHPLC 色谱柱的序列覆盖率类似，为99.0%。两种色谱柱均可鉴定总总76个胰蛋白酶消化肽段。但是， UHPLC分析产生了 700 bar背压， 而 AdvanceBio 分离的操作压力仅为 500 bar. AdvanceBio肽图分析色谱柱可获得类似 UHPLC的结果， 且具有在常规 HPLC仪器条件下操作的灵活性，因此这种色谱柱在进行快速高效肽图分析中更具吸引力。 图5.采用 2.1×100 mm 安捷伦及非安捷伦 UHPLC 肽图分析色谱柱分析 mAb 胰蛋白酶消化物。梯度：10-40%B， 0.6 mL/min， DAD：215nm，温度：40℃，流速：0.6mL/min。上图，采用安捷伦 AdvanceBio 肽图分析色谱柱进行 HPLC分离，可获得56个色谱峰，压力为 433 bar。下图，采用非安捷伦 UHPLC 多肽分析色谱柱进行 UHPLC分离， 可获得52个色谱峰，压力为 700 bar 图 6A. 采用2.1×100 mm Agilent AdvanceBio 肽图分析色谱柱(压力433 bar， 左图)及2.1×100 mm 非安捷伦 UHPLC 肽图分析色谱柱(压力700 bar，右图)所得的 mAb 胰蛋白酶消化物总离子流色谱图 (TIC)。色谱条件与图5条件相同 图6B. mAb 胰蛋白酶消化物的提取化合物色谱图(ECC)。上图， 2.1×100 mm Agilent AdvanceBio 肽图分析色谱柱， 433 bar， 获得99.63%序列覆盖率，鉴定到76个胰蛋白酶肽段。下图，非安捷伦 UHPLC 肽图分析色谱柱， 700 bar，获得99.0%序列覆盖率，鉴定到76个胰蛋白酶肽段 结论 AdvanceBio 肽图分析色谱柱可大大缩短 RP LC/MS 肽图分析的时间，同时可实现高分离度分离。结合优化的梯度条件，本应用举例说明了如何在 14 min 内以较低的液相色谱操作压力(<450 bar)完成单克隆抗体胰蛋白酶消化物的高效肽图分析。与非安捷伦 UHPLC肽图分析色谱柱及快速分析条件对比后，AdvanceBio 肽图分析色谱于用于分析mAb时，可在整个梯度范围内快速产生分离度良好的肽段峰，且序列覆盖率高。最重要的是， AdvanceBio 肽图分析分离是在低系统压力下完成，因此更突显其灵活性， 可在 HPLC或UHPLC 仪器条件下进行这些分离。 更多信息 这些数据代表典型结果。有关我们的产品和服务的详细信息，请访问我们的网站： www.agilent.com/chem/cn www.agilent.com/chem/cn 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 本资料中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 C安捷伦科技(中国)有限公司，2013 2013年12月6日，中国印刷 5991-3585CHCN Agilent Technologies 前言反相色谱(RP) 肽图分析是生物治疗药物分析中最主要的技术，可为生物制药产品提供全面的表征。当与质谱仪(MS) 联用时，能实现对蛋白质及其变异体的鉴定，确定翻译后修饰(PTM) 及其位点，并确认蛋白质序列。然而，由于蛋白质裂解物固有的复杂性，使得利用色谱进行肽图分析非常具有挑战性。因此，许多组织都致力于开发稳定、可靠的肽图分析方法。通常而言，肽图分析受到灵敏度低、峰形差及需要较长分离时间来达到所需分离度的影响。近年来，人们应用超高效液相色谱(UHPLC) 以克服这些挑战，与常规HPLC 相比，UHPLC 经证实具有超高分离度、更高的灵敏度，且可大大缩短分析时间。UHPLC 技术可更详尽地表征蛋白生物治疗药物，其通过加快流速、缩小粒径及缩短柱长，可在更短的分析时间内实现更高的分离性能。但是，这种类型的分离对压力要求越来越高，不能在常规的400 和600 bar 高效液相色谱仪上进行操作，严重地限制了其应用范围。为了解除这种限制，安捷伦引入一种2.7 μm AdvanceBio 肽图分析色谱柱以弥补生物治疗药物表征中的关键缺陷，可在常规液相色谱系统压力下，实现快速而高效的肽图分析。采用表面多孔色谱填料，AdvanceBio 肽图分析色谱柱可在很短的分析时间和低系统压力下大大改善肽图分析，同时保持很高的峰性能和分析效率。本研究采用AdvanceBio 肽图分析色谱柱，在较短的分析时间内对一种单克隆抗体(mAb) 胰蛋白酶消化物进行LC/MS 肽图分析。此外还将AdvanceBio 色谱柱及方法与一种亚2 μm 非安捷伦UHPLC 肽图分析色谱柱进行性能比较。结论AdvanceBio 肽图分析色谱柱可大大缩短RP LC/MS 肽图分析的时间，同时可实现高分离度分离。结合优化的梯度条件，本应用举例说明了如何在14 min 内以较低的液相色谱操作压力(< 450 bar) 完成单克隆抗体胰蛋白酶消化物的高效肽图分析。与非安捷伦UHPLC 肽图分析色谱柱及快速分析条件对比后，AdvanceBio 肽图分析色谱柱用于分析mAb 时，可在整个梯度范围内快速产生分离度良好的肽段峰，且序列覆盖率高。最重要的是，AdvanceBio 肽图分析分离是在低系统压力下完成，因此更突显其灵活性，可在HPLC 或UHPLC 仪器条件下进行这些分离。