化学药中唑来膦酸药物检测方案

离子色谱法对唑来膦酸药物的方法学的研究 刘红，王小树，孙焕2，李涛? (1.海南锦瑞制药股份有限公司，海口，5702082.瑞士万通中国有限公司中心实验室，北京，100192；) 摘要：采用离子色谱低压梯度淋洗及电导检测的方法对唑来膦酸药物进行了方法学研究，并对药物中的杂质成分磷酸和亚磷酸进行了分析。采用 Metrohm A Supp 5-100 色谱柱分离，唑来膦酸与其它相关离子的分离良好，磷酸和亚磷酸的定量限分别为36.6和25.8p g/L， 回收率分别为99.2%~100.9%，99.5%~100.9%。该方法简单快速，灵敏度高，重复性好，可用于唑来膦酸药物的测定和质量评价。 关键词：唑来膦酸；离子色谱；低压梯度 The methodology research of zoledronic acid by ion chromatography LIU Hong'， WANG Xiaoshu'， SUN Huan²，LI Tao? (1.Hai nan Jinrui pharmaceutical .CO.，LTD.Haikou，570208；2.Metrohm China Ltd. Beijing 100192，China) Abstract： A method was developed for the separation and determination of zoledronic acid by ionchromatography with suppressed conductivity detection coupled with low-pressure gradient.Theexcellent separation of zoledronic acid and its related substances was achieved with the column ofMetrohm A Supp 5-100. The minimum quantitative limit ofphosphate and phosphitewere 36.6p g/l and 25.8p g/l. The recovery of phosphate was between 99.2%~100.9%，and the recovery of phosphite was between 99.5%~100.9%. In conclusion， these resultsdemonstrated that the method proposed was simple， sensitive and reproducible for the analysis andquality evaluation of zoledronic acid. Key words： zoledronic acid， ion chromatography， low-pressure gradient 1前言 唑来膦酸(zoledronic acid) 是新型的双磷酸类(Bisphosphonates， BPs)药物，为一种特异性地作用于骨的二磷酸化合物，唑来膦酸的结构示意图如图1所示。该结构与骨质中的羟膦灰石呈高亲和力，并能与钙、铁等金属离子结合，形成可溶性或不可溶性复合物。唑来膦酸能抑制因破骨活性增加而导致的骨吸收2，降低血清钙和尿液中的钙排泄量。 图1唑来膦酸的分子结构 Fig.1 molecular structure of zoledronic acid 唑来膦酸的无机类杂质与药品临床使用的安全性密切相关，如果药品中存在的杂质未能通过有效的方法加以检出、控制，将给临床安全造成直接或潜在的危害。因此，制订合理、有效的药品杂质检测方法，控制药品中的杂质是一项非常重要的工作。研究中选取磷酸、亚磷酸两种在唑来膦酸药物生产过程中容易产生的杂质为研究对象。 虽然有报道可以用高效液相色谱法在线火焰分光光度法【3]、折光率法[4]、质谱法5]、 电感耦合等离子体法16.等测测技术分析唑来膦酸药物，但这些直接的检测技术也只是应用于少数特殊双膦酸类药物的含量测定，由于双膦酸类药物大多没有可直接应用紫外检测器器测的生色团，因此往往都需要进行衍生反应才能分析检测，过程繁琐，并且无法对其有关物质(磷酸、亚磷酸)进行研究。利用离子对色谱分离配以电导检测器，既解决了双膦酸类药物的保留问题，又解决了其检测问题，为该类药物提供了有效可靠的分析手段。 2实验部分 2.1主要仪器 850离子色谱仪(瑞士Metrohm公司)：配备电导检测器、英蓝超滤系统、MaglC Net 工作站)； 色谱柱： METROSEP A Supp5-100阴离子色谱柱(100mm×4.0mm×5pm)； BT 224S型电子天平 (Sartorius公司)；超纯水仪(英国Elga公司)。 1.2主要试剂 磷酸、亚磷酸、唑来膦酸、F、CI、Br、NO2、NO、PO3、SO2、PO标准品；碳酸钠(优级纯)：国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠(优级纯)：生物基本公司；实验用水为超纯水(电导率≥18.2 MQcm) 标准溶液配制： A：称取 45.7mg磷酸溶解后，定容至50mL容量瓶，量取4mL， 置于 50mL量瓶中，加注射用水至刻度，制成含磷酸盐为 73.12p g/mL 的溶液。 B：称取 64.4mg 亚磷酸溶解后，定容至 50mL容量瓶，量取2mL， 置于 50mL量瓶中，加注射用水至刻度，制成含亚磷酸盐为51.52ug/mL 的溶液。 A和B等体积混合后，分别取0.2mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL混合液，定容至10mL，制得 PO4梯度标准溶液浓度分别为 0.7312p g/mL、1.828p g/mL、3.656p g/mL、 7.312p g/mL、10.97p g/mL、14.62p g/mL； PO3梯度标准溶液浓度分别为 0.5152p g/mL、1.288p g/mL、2.576p g/mL、5.152p g/mL、7.728p g/mL、10.30p g/mL. 2结果与讨论 2.1实验条件 离子色谱分析中，淋洗液的种类和浓度对分离和检测灵敏度的影响较大。本实验使用低压梯度，当柱温为30℃，淋洗液：A：32mmol/LNazCO3+40m32mmol/LNaOH与B：HzO的梯度条件为：0至8min， A： B=10%： 90%；8至20min， A： 10%~50%；B： 90%~50%；20至24min，A： B=10%： 90%时，F、CI、Br、NO2、NO3、PO、SO、PO八种混合标准溶液分离谱图如图2所示， PO33、PO、唑来膦酸的分离谱图如图3所示。由图可知，各种离子能达到基线分离。 座 图2混合标准曲线 Fig.2 Calibration curve of standard solution 2.2精密度实验 取对照品溶液稀释10倍，重复进样6次，结果如表1： 表1精密度实验结果 Tab.1 experiment result of precision 序列号 亚磷酸根峰面积 磷酸根峰面积 亚磷酸根RSD/% 磷酸根RSD/% 1 0.700 0.790 2 0.688 0.798 3 0.703 0.805 1.2 1.9 4 0.702 0.821 5 0.714 0.829 6 0.706 0.819 2.3检测限实验 当磷酸根、亚磷酸根的混合标液浓度分别为3.656p g/ml2.576时，峰高H分别为1.847p S/cm、0.932p S/cm，噪音为0.000040p S/cm. 当信噪比(S/N)为3时，磷酸根的MDL=0.238p g/l，亚磷酸根的检出限为0.332p g/l.在样品中，亚磷酸根的定量限为：25.8pg/l；磷酸根的定量限为：36.6pg/l. 2.4回收率实验 分别称取磷酸、亚磷酸标准样品约0.25、0.312、0.375g(精确到0.0001g)，各精密称取3份，置于100mL容量瓶中，加纯净水溶解并稀释至刻度，摇匀，各准确量取0.1ml，分别置于25mL量瓶中，加纯净水稀释至刻度，摇匀，作为各样品溶液；各精密量取1mL，分别置于5mL量瓶中，各加本底样品母液2mL，加注射用水稀释至刻度，摇匀，制成理论限度值0.20%(2.0ug/ml)、0.25%(2.5ug/ml) 和0.30% (3.0ug/ml)的溶液。回收率结果见表2。 表2加标回收实验结果 Tab.2 recovery experiment result under standard material 相对浓度 磷酸根回 平均值(%) RSD(%) 亚磷酸根回 平均值 RSD(%) 收率(%) 收率(%) (%) 100.2 100.7 0.20% 100.0 99.51 99.9 100.4 0.25% 99.18 99.9 0.53 99.8 100.2 0.51 100.1 100.5 99.2 99.4 0.30% 100.9 100.9 99.8 100.2 99.9 100.0 由试验结果可知，磷酸回收率为99.2%~100.9%， RSD=0.53%；亚磷酸回收率为99.5%~100.9%， RSD=0.51%，回收率均较好，能够满足本品磷酸和亚磷酸的测定要求。 ( 参考文献 ) ( [1]刘东刚，王杰军.双膦酸盐类药物的发展.中国肿瘤临床.2003，30(9) ) ( [2]Wellington K， Goa K L. Drugs，2003，63(4)：417~437 ) ( [3] C hester T L， Lewis E C， -， Benedict JJ. Sunberg R J. Tettenhorst W C.J. Chromatoro.，1981，225：17~25 ) ( [4]Quitasol J， Krastins L.J. Chromatogr. A， 1994， 6 71：273~279 ) ( [5]Qin X Z， T sai E W， Sakuma T，Ip D P.J. Chromatogr.A，1994，686：205~212 ) ( [6] Reed D G ， M artin G P ， K onieczny J M， Brooks s M A . J. Pharm. Biomed.Anal..1995.13：1055~1058 )