人血清中一组内源性类固醇检测方案(液相色谱仪)

应用简报 Agilent临床研究 TTrusted Answers 利用 LC/MS/MS 定量测定人血清中的一组内源性类固醇 使用安捷伦固相支持液液萃取(SLE) Chem Elut S 板 Limian Zhao 安捷伦科技有限公司 Agilent Chem Elut S 固相支持液液萃取 (Chem Elut S) 使用合成填料，比传统硅藻土具有更出色的一致性和更高的持水容量。本研究展示了采用 Chem Elut S 2 mL 96 孔板对人血清中的一组共15种内源性类固醇进行 LC/MS/MS 定量测定。使用固相支持液液萃取 (SLE) 对血清样品进行前处理，以提取目标分析物，并去除基质干扰物质，如盐、蛋白质和部分磷脂。整个样品处理在96孔板中作为一个批处理进行，首先将水溶液样品加载到SLE 吸附剂上，然后使用与水不混溶的溶剂进行重力洗脱。与传统的液液萃取(LLE)相比， Chem Elut S 的板内工作流程可大大节省时间和人力。针对血清中目标类固醇浓度为 5-10000 pg/mL 的宽校准范围(雌二醇和睾酮的校准范围为 10-10000 pg/mL， 氢化可的松、、17-羟基孕烯醇酮和孕酮的校准范围为20-10000 pg/mL)， 对建立的 SLE 方法进行验证，该方法表现出优异的方法分析物准确度 (80%-120%)和重现性 (RSD<15%)。还对方法选择性和交叉污染进行了评估，五种分析物定量限 (LOQ)升高归因于方法在血清基质中的选择性。此外，在给定的样品萃取溶剂下，合成的 SLE 吸附剂与基于硅藻土的 SLE 以及传统LLE 相比，能够更好地去除生物体液基质中的磷脂。 前言 传统 LLE 广泛用于萃取生物样品基质(如血清和血浆)中的内源性类固醇，在衍生化或未衍生化条件下进行类固醇分析1-3。在这些方案中，通常将生物样品(如血清或血浆)等分试样加入单独的微量离心管中，随后加入萃取溶剂。样品在混合和离心后，将上层有机相转移到另一组样品管或96孔板中，进行后续样品处理。在实践中，该方案包括多个费力且耗时的步骤，例如管标记、样品混合、相分离和有机层转移，均是实现高通量样品前处理的限速步骤。 一种能克服这些缺点的 LLE 替代方法是SLE。 SLE 小柱的吸附剂为覆盖到其表面上的水溶液样品提供了化学惰性表面。经过平衡后，在重力、轻度真空或压力作用下，使用与水不混溶的溶剂洗脱目标分析物，同时水相保留在小柱中。由于 SLE吸附剂提供了较大的水性表面积，因此目标分析物在流经填料时被高效萃取到有机溶剂中。图1显示了萃取过程。对于 SLE， 无需混合步骤，可以有效防止形成乳浊液。此外，水相和有机相之间的紧密接触可实现高效分配，从而提供更高的分析物回收率。由于仅需上样和洗脱步骤，SLE 工作流程非常简单，大大减少了人力和时间要求。最后，96孔板 SLE 特别适合自动化，可提高样品前处理通量。 传统上，用于 SLE的吸附剂为高度纯化的硅藻土。然而，硅藻土是一种天然材料，由不规则的化石微生物组成，难以控 制吸附剂颗粒的批次间一致性。吸附剂差异性增加了产品制造和质量控制的难度，并导致产品性能不一致。此外，与合成填料相比，硅藻土持水容量更低且批次间不一致性更大。 Chem Elut S 合成吸附剂极大改善了持水容量、批次间一致性和性能一致性。本应用简报展示了采用 Chem Elut S 96 孔板对人血清中的一组共15种内源性类固醇(表1)的定量测定。 表1.15种目标类固醇的分子式和结构 名称 Log P 分子式 结构 氢化可的松(HCTS) 1.6 C21H300s HO OH HO OHA 雄烯二酮(ASD) 2.7 C19H2602 HA O 17-a-羟基孕烯醇酮(17-0H PGN) 3.1 C21H320： HO ：O OHHA HO 11-脱氧皮质酮(11-DCCS) 2.9 C21H300 OH HH 醛固酮 1.1 C21H280s OH HOH 雌酮(E1) 3.1 C18H2202 HO 可的松 (CTS) 1.5 C21H280s HO OH OH A 睾酮(TTS) 3.4 C1gH2802 A A (Center Valley， PA， USA)。氟化铵、所有类固醇标准品品内标储备液(1 mg/mL的 MeOH 溶液或 100 ug/mL 的 MeOH溶液)购自Sigma-Aldrich (St. Louis， MO，USA)。人血清 (DC Mass Spect Gold，MSG4000) 购自 Golden West Biologicals，Inc.(Temecula， CA， USA)。血清在使用前保存于-70℃下。 标样和溶液 标准加标溶液在1：1 MeOH/水中制得，浓度为 500 ng/mL， IS 加标溶液在1：1MeOH/水中制得，浓度为 50 ng/mL。类固醇化合物对玻璃表面敏感，尤其在低浓度下。因此，使用塑料瓶来配制和储存所有加标溶液非常重要。所有加标溶液在使用前保存于-20°℃下。 将 37.04 mg NHF 溶于1L Milli-Q水和MeOH中，制得1 mmol/L 氟化铵(NHF)的水溶液和 MeOH 溶液。分别用 Milli-Q水和 MeOH 稀释 1 mmol/L 溶液，制得0.2 mmol/L NHF 水溶液(流动相A)和0.2 mmol/L NHF MeOH 溶液(流动相B)。 通过混合100 mL MTBE 和 EtOAc， 新鲜配制 1：1 MTBE/EtOAc 萃取溶剂，并在当天使用。在 SLE 之后，利用1：1MeOH/水溶液复溶干燥的样品。 设备与材料 用于样品前处理的设备包括： Centra CL3R 离心机 (Thermo IEC，MA， USA) 多管涡旋仪(VWR， PA， USA) Eppendorf 移液管和重复用移液器SPE 一式 96 蒸发器 ( 安捷伦正压96孔处理装置(PPM-96，部件号5191-4116) ) ( ViaFlo 96 液体处理器 (Integra， Hudson， NH，USA) ) ( Agilent Chem Elut S 2 mL 96 孔板， 200pL ( 部件号5610-2003) ) ( 安捷伦方形96孔2mL收集板(部件号5133009) ) ( 安捷伦方形96孔密封盖 ) (部件号5133005) 样品在 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统上运行，该液相色谱系统包括Agilent 1290 Infinity 二元泵 (G4220A)、Agilent 1290 Infinity 高性能自动进样器(G4226A) 和 Agilent 1290 Infinity 柱温箱(G1316C)。该 UHPLC 系统与配备安捷伦 喷射流 iFunnel 电喷雾离子源的 AgilentG6490 三重四极杆液质联用系统联用。采用 Agilent MassHunter 工作站软件进行数据采集和分析。 表2中列出了分析物参数，图2显示了血清中1 ng/mL 类固醇的 LC/MS/MS色谱图。 HPLC条件 色谱柱 Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18， 100×2.1 mm， 1.8 pm (部件号959758-902) Agilent ZORBAX RRHD C18保护柱，5×2.1 mm， 1.8 pm (部件号821725-901) 流速 0.4 mL/min 柱温 40°C 进样量 20 pL 流动相 A) 0.2 mmol/L 氟化铵水溶液 B)0.2 mmol/L 氟化铵的甲醇溶液 进样针清洗 1：1：1：1ACN/MeOH/IPA/H，0 (含0.2%FA) 梯度 时间(min) %B 流速(mL/min) 0 50 0.4 3.0 60 0.4 8.0 90 0.4 8.5 100 0.4 停止时间 8.5 min 后运行时间 2.5 min 质谱条件 气体温度 180°℃ 气体流速 11 L/min 雾化器 20 psi 鞘气温度 400°℃ 鞘气流速 10 L/min 毛细管 3500V(正离子模式)；3000V(负离子模式) iFunnel 参数 高压RF： 150V(正离子和负离子模式) 低压RF： 100V(正离子和负离子模式) 数据采集 dMRM 表2.类固醇分析物、所用用内标、保留时间和 MRM 条件 分析物 所用的内标 保留时间(min) 极性 母离子(m/z) 子离子 (m/z) 定量离子 CE(V) 定性离子 CE (V) 雌三醇 IS1 2.04 负 287.2 171.0 45 143.1 73 醛固酮-D4(IS1) 2.31 正 365.2 347.1 17 319.2 21 醛固酮 IS 1 2.32 正 361.2 343.2 17 91.1 80 可的松-Dg(IS2) 2.71 正 369.2 169.2 21 125.1 49 可的松 IS 2 2.75 正 361.2 163.2 25 91.0 73 氢化可的松 IS 2 3.24 正 363.2 121.1 25 91.1 73 17-羟基孕烯醇酮 IS 2 3.24 负 331.2 313.2 21 -- 11-脱氧皮质醇-Ds(IS3) 4.53 正 352.3 100.0 37 113.0 45 11-脱氧皮质醇 IS 3 4.58 正 347.2 109.0 41 97.0 41 雄烯二酮 IS3 5.31 正 287.2 97.0 25 109.0 29 雌二醇-Ds(IS4) 5.39 负 276.2 147.0 45 187.0 49 雌酮-cs(IS5) 5.43 负 272.3 148.0 41 146.0 61 雌酮 IS5 5.42 负 269.1 145.0 49 143.1 73 雌二醇 IS4 5.45 负 271.2 145.1 49 183.0 49 11-脱氧皮质酮 IS 3 5.72 正 331.0 97.1 25 109.1 33 2-甲氧基雌酮 IS5 5.85 负 299.2 284.1 25 睾酮 IS6 5.86 正 289.3 97.1 23 109.1 25 2-甲氧基雌二醇 IS 4 6.01 负 301.2 286.2 25 -- 17-羟基孕酮-Dg (IS6) 6.21 正 339.3 100.1 45 113.2 37 17-羟基孕酮 IS6 6.26 正 331.2 109.1 33 97.1 29 孕酮-D，(IS7) 7.39 正 324.3 100.1 29 113.0 25 孕酮 IS 7 7.44 正 315.2 97.1 25 108.9 37 ×102 图 2.使用 Agilent Chem Elut S 固相支持液液萃取方法前处理的血清中1 ng/mL 类固醇的 LC/MS/MS 色谱图 校准标样和QC样品前处理 使用 500 ng/mL 标准加标溶液(溶于1：1MeOH/水中)配制血清中浓度为50 ng/mL 的中间标准加标溶液。然后利用该中间标准加标溶液配制人血清中的校准曲线标样。将适当体积的中间标准加标溶液加入血清空白中，制得浓度为5、10、20、50、100、500、1000、5000和10000 pg/mL 的校准标样。在准确度和精密度方法验证测试中，运行四个浓度的质量控制(QC)样品，包括浓度为定量下限(LLOQ) 5(10/20) pg/mL 的 QC样品、浓度为 100 pg/mL 的中等浓度 QC样品、浓度为 1000 pg/mL 的高浓度 QC样品以及浓度为定量上限 (HLOQ) 10000pg/mL 的 QC样品。这些QC样品通过加入合适体积的血清中间样品制得。所有校准标样和 QC样品都在2mL卡口盖管或5mL 塑料管中制得。然后将其等量加入96孔板中进行萃取。 样品萃取 SLE 萃取优化是基于对分析物回收率和基质净化度的考虑，包括溶剂的选择以及洗脱体积和时间。图3详细介绍了最佳样品前处理程序。整个方案包括四个主要部分：将等分试样加载到板上，与 IS 混合并转移至 SLE 板，在 SLE 板上进行样品萃取，以及在收集板上进行样品后处理。将血清样品等量加入1mL收集板中，随后加入 IS 加标溶液。样品涡旋混合后，将整个样品混合物转移至 Chem Elut S 2mL板，其下方有一个2mL 方形收集板。将萃取溶剂添加到SLE 板时要谨慎操作，避免因溶剂飞溅而导致交叉污染。使用重力进行洗脱，最后进行吸附剂干燥 步骤，此时应缓慢引入压力或真空。由于使用挥发性溶剂 MTBE 和EtOAc 进行萃取，因此在通风橱中执行萃取步骤非常重要。 将200pL血清样品等量加入1mL收集板中 向每个样品中加入10 pL IS 加标溶液。盖上并并涡旋混合30秒 将整个样品混合物转移至 Agilent Chem Elut S 板(200mg)， 其下方带有2mL收集板 施加 2-3 psi 的压力，将水溶液样品加载至 SLE 吸附剂床层中 平衡5分钟 向每个孔中加入400 pL 1：1 MTBE/EtOAc， 进行重力洗脱 当孔中不存在可见液体时，另外加入400 pL1：1 MTBE/EtOAc 进行重力洗脱 重复以上步骤。总共使用400 pL×3进行重力洗脱 当所有孔中都不存在可见液体时，施加约6 psi的压力，使小柱干燥 取下收集板，在40℃下用N2流吹干整个洗脱液 用100 pL1：1 MeOH/H20复溶；用方形板垫盖上板 将板涡旋混合2分钟，超声处理3分钟，然后离心2分钟。随后样品可直接进行 LC/MS/MS分析 图3.利用 Agilent Chem Elut S 2 mL 板(200pL)进行血清中类固醇分析的样品前处理工作流程方案 方法验证 采用为期三天的准确度和精密度(A和P)运行来验证方法。由于每天的A和P运行使用三批不同的SLE 板，因此为期三天的A和P方法验证也用于进行 SLE板的批次间重现性测试。对校准标样和QC 样品进行合适的预加标。按照以下顺序将样品等量加入收集板中：双基质空白、基质空白(加标IS)、第一组校准标样、2-3个基质空白、LLOQ(n=6)、中等浓度 QC(n=6)、高浓度 QC(n=6)、HLOQ (n = 6)、2-3个残留基质空白、双基质空白、基质空白、第二组校准标样、2-3个基质空白。 方法和产品比较 将经验证的 SLE 方法与 LLE 以及基于硅藻土的 SLE 进行分析物回收率、重现性(RSD)、基质效应和校准曲线线性比较。 比较血清中 1 ng/mL 的预加标和后加标QC样品之间的分析物仪器响应(峰面积)，对分析物绝对回收率进行研究。将预加标的QC样品适当地直接加入血清中，并利用开发的方法对样品进行前处理。萃取后，将后加标的QC样品加标至基质空白中。具体来说，后加标发生在样品的复溶阶段，是使用适当的纯标准溶液复溶干燥的基质空白样品。比较后加标QC样品和试剂空白溶剂中制得的对应纯标样之间分析物的仪器响应(峰面积)，对基质效应进行研究。 基质磷脂去除 通过监测磷脂谱图，对基质净化度进行考察。使用 Chem Elut S 板进行的血清样品萃取展示了部分磷脂去除。对处理后的血清与其他种类血浆的基质空白磷脂曲线进行了对比。使用 Chem Elut S板和竞争对手对应的基于硅藻土的 SLE 板， 进一步对比了使用不同萃取溶剂对磷脂去除的影响。 本研究的重点是展示在临床研究应用中使用 Chem Elut S 板进行血清中类固醇的定量测定。 方法开发与优化 仪器方法和特别注意事项：使用ESI或APCI离子源时，五种类固醇分析物(雌三醇、雌激素、雌二醇、2-甲氧基雌激素和2-甲氧基雌二醇)非常难以电离。在常规条件下，即使在高浓度下，也很难观察到这些化合物的信号。可以选择对这些化合物进行衍生化，但是需要在样品前处理过程中增加额外步骤。对于衍生化和未经衍生化的类固醇，也很难执行联合样品前处理方法。据报道，使用氟化铵缓冲液有助于负离子模式下的电离4，并能大大提高类固醇的分析灵敏度5。基于这些认识，针对那些难以电离的类固醇化合物采用 1 mmol/L 氟化铵缓冲液作为流动相，使仪器分析灵敏度得以显著改善。对缓冲液浓度的进一步考察发现，更低的氟化铵浓度(0.2 mmol/L) 可提供更出色的分析灵敏度。此外，流动相A和B中相同的盐浓度能提供更加一致的结果。然后将最佳条件确定为，以 0.2 mmol/L 氟化铵的水溶液和 MeOH 溶液分别作为流动相 A和B。 如之前所述5，使用氟化铵缓冲液不仅能提高这些难以电离的类固醇化合物在负离子模式下的电离效率，还能提高其他化合物在正离子模式下的电离效率。对于整组15种类固醇分析物，基于该条件建立 了仪器方法。图4显示了血清中浓度为定量限 (LOQ) 5 pg/mL 的E1和E2色谱图，证明方法分析灵敏度得到改善。需要重点注意的是，类固醇化合物对玻璃表面非常敏感，尤其在低浓度下。使用玻 SLE 方法优化： SLE 方法可基于现有的LLE 方法进行开发，也可以直接在 SLE小柱或样品板上开发。本研究参考目前已公开的 LLE 方法，直接在 SLE 板上优化SLE 方法。 SLE 方法优化包括溶剂、溶剂混合物和样品洗脱优化。优化基于对平均分析物回收率、RSD 和基质效应的组合评估，如图5所示。 首先考察萃取溶剂，对四种常用的 LLE溶剂/溶剂混合物进行了评估： MTBE、乙醚(DEE)、EtOAc 和 DCM/MTBE(1：4)。如图5中第一组用于溶剂选择的对 比(左图)所示， MTBE 萃取时平均基质效应最佳，表明基质最洁净，但是平均回收率较低。 EtOAc 萃取时萃取效率最高，但是也导致了更强的基质离子抑制效应。DEE 和 DCM/MTBE混合物萃取时均具有较低的分析物回收率，并且 DCM/MTBE萃取的重现性较差。因此，进一步考察了MTBE/EtOAc 的混合物，以找出分析物回收率与基质效应之间的最佳平衡。 在图5中用于溶剂混合物优化的第二组对比(中间图)中，将 MTBE 和 EtOAc以 1：1、2：1和1：2的比率混合并用于样 品萃取。图5表明，1：1 MTBE/EtOAc 混合物萃取在分析物回收率和基质效应之间实现了最佳平衡，因此被选为最佳萃取溶剂。这些研究基于使用 500 pL 溶剂进行两次萃取。使用400 pL最佳溶剂进行三次萃取，以进一步研究样品萃取情况。结果如图5中的第三组对比(右图)所示。使用400 uL洗脱液进行三次萃取后，平均分析物回收率进一步提高，且基质效应不受影响。因此，通过使用400pL的1：1MTBE/EtOAc 进行三次萃取实现了对 SLE 方法的优化。 图5.针对溶剂选择和样品洗脱的 SLE 方法优化，优化基于对平均分析物回收率、RSD 和基质效应的组合评估 方法验证 通过为期三天的准确度和精密度运行收集完整的定量结果，对优化的方法进行验证。表3中显示的结果包括校准曲线数据和三天/批次准确度和精密度数据。使用线性回归和1/x²的权重生成所有分析物的校准曲线，它们的R²均高于 0.99。大多数分析物在血清中的 LOQ 为5 pg/mL， 但由于基质干扰或基质空白中存在某些分析物，导致以下化合物除外：雌二醇和睾酮的 LOQ 为10 pg/mL，孕酮、17-羟基孕烯醇酮和氢化可的松的LOQ 为 20 pg/mL。 为期三天的准确度和精密度运行不仅验证该方法能够实现可靠 的定量，而且由于使用三个不同生产批次的SLE 板，还证明了 Chem Elut S 板具有良好的批次间重现性。图6显示了基于分析物准确度和精密度的 SLE 板批次间重现性汇总结果。 表3.定量测定人血清中的15种类固醇化合物的方法验证结果 图6.基于准确度和精密度的 Agilent Chem Elut S 方法的日间验证与板批次间性能重现性汇总 方法和产品比较 基于分析物回收率、重现性、基质效应和校准曲线线性，对开发的 Chem Elut S 方法与传统的 LLE 和竞争对手的硅藻土 SLE进行了方法性能比较。 SLE 与 LLE 相比可明显节省人力和时间。SLE 工作流程节省了样品混合、相分离和有机相上清液转移等关键步骤所需的人力和时间，从而显著提高了样品前处理效率。省去这些步骤后，根据样品数量不同， SLE 方法能够轻松节省50%或更多 的时间。除节省时间和人力外， SLE 程序还可防止形成乳浊液，提高方法可靠性。 图7显示了基于分析物回收率(7A)和重现性(7B)的方法性能比较。 SLE 方案实现了水相和有机相之间的紧密接触，可实现高效分配，从而提高分析物回收率。与LLE方法相比，使用SLE 方法时分析物的整体回收率增加了10%至20%。更高的分析物回收率可提高分析物响应，从而获得更出色的方法分析灵敏度。 使用基于硅藻土的 SLE 实现了相当或稍高的回收率，然而观察到明显的孔间差异性，尤其对于极性较强的分析物。其原因可能在于硅藻土吸附剂和持水容量不一致。由于 Chem Elut S 板提供了良好的孔间重现性和方法分析灵敏度，因此校准曲线线性也得到了改善。所有这些改善使定量方法更可靠、更一致。 图 7. LLE、Agilent Chem Elut S 和硅藻土 SLE 的方法和产品性能比较 基质磷脂去除 使用 Chem Elut S 板进行生物体液前处理也可以去除部分磷脂。 本研究使用去除了激素的血清，以便在目标类固醇的极低定量限下实现良好的基质选择性。然而，经处理的血清也去除了磷脂，对于其他应用测试可能并不需要。为考察磷脂去除，使用标准 LLE、Chem Elut S 和竞争对手的硅藻土 SLE 方法对未经处理的血浆基质中的磷脂进行分析。图8A中的曲线对比结果显示，使用 MTBE 溶剂的 Chem Elut S 方法的磷脂去除率比竞争对手的硅藻土 SLE 方法高99%，比基于 MTBE 的 LLE方法高30%。对不同类型的血浆使用不同的萃取溶剂，进一步比较研究 Chem Elut S 和硅藻土SLE的方法性能，结果如图8B所示。基于丰度对磷脂总响应进行归一化。研究结果表明： 不同类型的血浆具有不同的磷脂丰度，其中脂性血浆中磷脂最为丰富 不同溶剂可实现不同程度的磷脂萃取， 其中 EtOAc 和 DCM 比 MTBE 和DEE 能萃取更多磷脂 与竞争对手的硅藻土 SLE 相比，Chem Elut S 可实现更高效的磷脂去除 采集时间 (min) B 血浆基质空白磷脂总响应对比 硅藻土 SLE 与 Agilent Chem Elut S 硅藻土 SLE Chem Elut S 图8.使用不同溶剂得到的 Agilent Chem Elut S、硅藻土 SLE 与 LLE 对血浆中的磷脂去除比较 开发出一种使用 Agilent Chem Elut S2 mL 板的样品前处理方法，并验证了该方法对人血清中一组共15种类固醇化合物的定量测定。基于分析物回收率、方法重现性和基质效应，对 SLE 方法的所用溶剂和样品洗脱进行了优化。为期三天的准确度和精密度运行证实，该方法具有可接受的校准曲线线性、卓越的日内和日间准确度和精密度、优异的分析物回收率和方法重现性。与标准 LLE 和硅藻土 SLE相比， Chem Elut S 方法比标准 LLE 提供了更高的总体分析物回收率，并且比硅藻土 SLE 具有更出色的吸附剂一致性和孔间小柱重现性。它还为生物体液基质(如血浆和血清)提供了高效的磷脂去除。在96孔板形式上开发的方案非常适合高通量实验室中的快速自动化样品前处理需求。便捷的上样和洗脱程序还简化了液体萃取工作流程，从而大大节省人力和时间。 Chem Elut S 具有高于硅藻土吸附剂的样品保持能力，可提供高效的样品吸附并降低样品穿透的可能性。新型板设计提供了： 用于样品和洗脱液的较大顶空区域 方形上部滤芯，可在施加压力或真空之前保持样品 全裙板，以实现良好的硬件兼容性快速、一致的洗脱 ( 1. . Anari， M. R . ； et al. Der i vatization ofEthinylestradiol with Dansyl Chlorideto Enhance E l ectrospray lonization：Application in Trace Analysis ofEthinylestradiol in Rhesu s MonkeyPlasma. Analytical Chemistry 2002，74，4136-4144 ) ( 2. Lee， J. S.； et al. Comparison of methods to measure low serum estradiol levels in postmenopausal women. J o urnal of Clinical Endocrinology and Metabolism 2 0 06， 91，3791-3797 ) ( K ushnir， M. M .； et al. Hi g h-SensitivityTandem Mass Spectrometry Assay for Serum E strone and Estradiol. Clinical Chemistry 2008， 1 29， 530-539 ) ( Wang， W . ； Cole， R. B .； EnhancedCollision-Induced DecompositionEfficiency and Unraveling ofFragmentation Pathways for AnionicAdducts of B revetoxins in NegativeIon Electrospray Mass Spectrometry.Analytical Chemistry 2009，81，8826-8838 ) ( H indle，R. I mproved Analysis of TraceHormones in Drinking Water byLC/MS/MS (EPA539) using theAgilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS (使用 Agilent 6460 三重四 极杆液质联用系统通过 LC/MS/MS改善饮用水中痕量激素的分析(EPA539))，安捷伦科技公司应用简报，出版号5991-2473EN， 2013 ) 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线：800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 仅限研究使用。不可用于诊断目的。 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 5994-0949ZHCN Agilent Chem Elut S 固相支持液液萃取 (Chem Elut S) 使用合成填料，比传统硅藻土具有更出色的一致性和更高的持水容量。本研究展示了采用 Chem Elut S 2 mL 96 孔板对人血清中的一组共  15  种内源性类固醇进行  LC/MS/MS  定量测定。使用固相支持液液萃取  (SLE)  对血清样品进行前处理，以提取目标分析物，并去除基质干扰物质，如盐、蛋白质和部分磷脂。整个样品处理在  96  孔板中作为一个批处理进行，首先将水溶液样品加载到  SLE  吸附剂上，然后使用与水不混溶的溶剂进行重力洗脱。与传统的液液萃取  (LLE)  相比，Chem  Elut  S  的板内工作流程可大大节省时间和人力。针对血清中目标类固醇浓度为  5–10000  pg/mL  的宽校准范围（雌二醇和睾酮的校准范围为  10–10000  pg/mL，氢化可的松、17-羟基孕烯醇酮和孕酮的校准范围为 20–10000 pg/mL），对建立的 SLE 方法进行验证，该方法表现出优异的方法分析物准确度 (80%–120%) 和重现性 (RSD < 15%)。还对方法选择性和交叉污染进行了评估，五种分析物定量限  (LOQ)  升高归因于方法在血清基质中的选择性。此外，在给定的样品萃取溶剂下，合成的 SLE 吸附剂与基于硅藻土的 SLE 以及传统 LLE 相比，能够更好地去除生物体液基质中的磷脂。