血清中脂溶性维生素检测方案(液相色谱仪)

「应用纪要1WatersTHE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. [应用纪要] 使用UPLC Xevo TQ-S IVD系统快速分析血清中5种脂溶性维生素 技术优势 使用Xevo TQ-SIVD系统，标配的ESI源，一针进样，同时分析五种脂溶性维生素成分，分析效率大大提高。 ACQUITY UPLCI-Class超高效液相显著缩短运行时间，提高样品通量，减少溶剂用量。 使用PRiME HLB uElution板进行快速的样品前处理，富集目标成分的同时更有效去除血清基质中的干扰物。 沃特世解决方案 ACQUITY UPLCI-Class系统 ACQUITY UPLC BEH Phenyl色谱柱 Xevo TQ-S IVD Masslynx软件PRiME HLB pElution板 关键词 脂溶性维生素、固相萃取、血清、ESI(+)、定量分析 前言 维生素A、维生素D、维生素E和维生素K1均为脂溶性维生素。维生素A又称视黄醇，主要生理作用为促进细胞的增殖和生长，保护器官上皮组织结构的完整和健康，维生素A的缺乏可引发全身性病变，可引起视觉功能障碍，乃至皮肤、骨骼及免疫系统。维生素D又称钙化醇，在人体内主要以两种形式存在，维生素D2(麦角钙化醇)和维生素D3(胆钙化醇)。维生素D的生理作用为维持正常的钙、磷代谢，对于维持钙的代谢和骨骼的正常发育有极其重要的作用。维生素D在肝脏可转化为25羟基维生素D(25OH-VD)，其度度水平与体内的维生素D直接相关，因此体内25OH-VD2、25OH-VD3可作为检测维生素D水平的生物标志物。维生素E又称生育酚，其中a-生育酚的活性最高，主要参与脂肪代谢，维持内分泌的正常机能，使性细胞正常发育，提高繁殖性能。维生素K1，又称为叶绿醌，在食物和人体中广泛存在。维生素K1是肝脏合成凝血因子II、VI、IX、X不可缺少的物质；缺乏时会引起低凝血酶原血症，出现凝血障碍。由于这5种脂溶性维生素在血清中的含量范围差异较大，维生素A和维生素E的含量很高，而维生素D2和维生素K1的含量很低，并且血清中含有大量的干扰物质，因此同时测定血清中这5种脂溶性维生素非常困难。 本应用纪要使用固相萃取的前处理方法净化富集血清中VA、25OH-VD2、25OH-VD3、VE和VK1，色谱分离用BEH Phenyl色谱柱(2.1×50 mm， 1.7 um)，采用Waters UPLCI-Class Xevo TQ-SIVD超高灵敏度的三重四极杆质质，ESI(+)的离子化方式，建立了血清样品中同时检测五种脂溶性维生素的快速、简便、高灵敏度的定量分析方法。 UPLC条件 UPLC系统： Waters ACQUITY UPLC I-Class 色谱柱： ACQUITY UPLC BEH Phenyl色谱柱， 2.1x50mm， 1.7um 柱温： 45°C 流速： 0.4mL/min 流动相A： 0.1%甲酸的水溶液 流动相B： 0.1%甲酸的甲醇溶液 进样体积： 10pL 梯度： 见表2 时间 (min) 流速 (mL/min) %A %B Curve 0 0.4 20 80 - 0.5 0.4 20 80 6 3.0 0.4 2 98 6 3.5 0.4 2 98 6 4.0 0.4 20 80 1 表2.UPLC的梯度条件。 质谱条件 MS系统： Xevo TQ-SIVD 电离模式： ESl+ 毛细管电压： 2.5kV 脱溶剂气温度： 500°C 脱溶剂气流量： 1000L/h 源温度： 150°C 采集： MRM分析(表4) 实验方案 仪器信息 1.液相-ACQUITY UPLCI-Class 2. 质谱-Xevo TQ-S IVD 中文名称 英文名称 简称 分子式 分子量 内标 形式 维生素A/视黄醇 Vitamin A VA C20H300 286.2 d6 25羟基维生素D2 25OH Vitamin D2 250H-VD2 C28H4492 412.3 d3 25羟基维生素D3 25OH Vitamin D3 250H-VD3 C274492 400.3 d3 维生素E/a-生育酚 Vitamin E VE 430.3 d6 维生素K1/叶绿醌 Vitamin K1 VK1 CaH469 450.3 d7 表1，待测化合物的信息。 图1.VA、VE、25OH-VD2、25OH-VD3和VK1的结构式。 中文名 型号 Waters货号 BEH Phenyl色谱柱 2.1x50mm， 1.7 um 186002884 Oasis PRiME HLB SPE pElution plate， 3 mg 186008052 96孔样品接收板(圆孔) 700pL，25/pkg 186005837 粘性封膜 100/pkg 186006336 96 well plate预切口盖垫 5/pkg 186006332 化合物 MRM(m/z) 锥孔能量(V) 碰撞能量(eV) VA 269.2>81.1 20 8 269.2>93.1 8 VA-d6 275.2>96.1 20 8 250H-VD2 395.2>119.1 20 20 413.2>113.1 20 25OH-VD2-d3 398.2>122.1 20 20 25OH-VD3 383.2>257.2 20 14 401.3>383.2 8 25OH-VD3-d3 404.3>386.2 20 8 VE 431.3>83.1 20 5 431.3>165.1 5 VE-d6 437.1>171.1 20 14 VK1 451.4>185.1 40 22 451.4>187.1 22 VK1-d7 458.4.1>194.1 40 22 表4.5种脂溶性维生素的标准品和内标在Xevo TQ-SIVD上的MRM参数。 储备液和标准曲线的配制 VA、25OH-VD2、25OH-VD3、VE和VK1的标准品和内标购于sigma，混标储备液的浓度为VA：20 pg/mL，25OH-VD2：1pg/mL，25OH-VD3：1pg/mL， VE： 200 pg/mL， VK1： 0.5 pg/mL溶于含0.1%BHT的甲醇中。使用时用逐级稀释的方法分别配制不同浓度的混合溶液做储备标曲(VE：20 ng/mL-20pg/mL).混合内标工作液为50 ng/mL的VA-d6， 20ng/mL的25OH-VD2-d3，20 ng/mL的25OH-VD3-d3，100 ng/mL的VE-d6，10ng/mL的VK1-d7，溶于含0.1%BHT的乙腈中。 质控样品的配置 本实验使用用含维生素AE的血加标的方法制备高中低浓度的质控样品。因为VA、25OH-VD2、25OH-VD3、VE和VK1五个化合物在血清中的正常范围不一样，所以加标浓度也不一样，我们分别配置了加标浓度如表6所示的质控品。每个待测物选择不同浓度的质控品考察加标回收率、批内和批间精密度。 样品预处理 取100pL血清或标准品加300pL内标工作液，涡旋混匀1min，加300pL超纯水，涡旋混匀1 min.13000g离心5分钟。 Dilute： 20 uL H，O 图2.前处理流程图。 Oasis PRiME HLB uElution SPE流程 根据图2所示方案提取预处理后的标准品或血清样品，然后在96孔板的板温震荡仪上摇匀1 min后进LC-MS/MS分析。 实验结果 标准品和实际血清样品的分离色谱图 5种脂溶性维生素的标准品用BEH Phenyl 色谱柱分离、Xevo TQ-SIVD系统检测的代表性MRM色谱图见下图3(A)。图3(B)是血清样品经固相萃取法纯化富集后检测的色谱图，可以看出固相萃取前处理后的样品几乎没有干扰，每个待测物都可以进行准确定量分析。 图3. (A) VA： 50ng/mL， 250H-VD2： 2.5ng/mL， 250H-VD3： 2.5ng/mL， VE：500ng/mL， VK1： 1.25ng/mL标准品、(B)混合血清样品，经固相萃取纯化富集后检测的色谱图。 线性 分别配制2-2000 ng/mL的VA；0.1-100 ng/mL的25OH-VD2和25OH-VD3标准品；20-20000ng/mL的VE；0.05-50ng/mL的VK1的混合标样，加内标经固相萃取法样品前处理后，进质谱分析，检测方法的线性(见图4).分析物浓度和响应值(分析物峰面积/IS峰面积)之间呈线性，且线性相关系数r2>0.997，定量限和线性范围见表5。 图4.(A)VA、(B)25OH-VD2、(C)25OH-VD3、(D)VE、(E)VK1在Xevo TQ-S IVD上的标准曲线，采用1/x加权线性拟合。 化合物 定量限(ng/mL) 线性范围(ng/mL) 线性方程 r2 VA 2 2-2000 Y=0.0043027X+0.00174202 0.9983 25OH-VD2 0.5 0.5-100 Y=0.151031X+0.00443447 0.9981 25OH-VD3 0.5 0.5-100 Y=0.0342317X+0.00264659 0.9977 VE 20 20-20000 Y=0.000650606X-0.000926659 0.9996 VK1 0.125 0.125-50 Y=0.0385282X+0.000531017 0.9997 表5.VA、25OH-VD2、25OH-VD3、VE、VK1在Xevo TQ-S上的检测限、线性范围和线性方程。 因为人血清中的VA和VE的含量很高，本实验采用不含维生素AE的血作替代基质考察5种脂溶性维生素的加标回收率。根据VA、25OH-VD3、25OH-VD2、VE、VK1在人血清中的正常浓度范围分别在混合血浆中添加低、中、高浓度的混合标准品。其中VA的低、中、高加标浓度分别为50、250和1000 ng/mL；25OH-VD3的低、中、高加标浓度分别为5、10和50ng/mL； 25OH-VD2因为在正常血浆中的浓度非常低，所以低、中、高加标浓度分别为2.5、5和10 ng/mL；VE的低、中、高加标浓度分别为2000、5000和10000 ng/mL.实验时会同时处理高、中、低加标的6个不同浓度样本，每个浓度点各处理5个样品，每个样品进样1针，根据5针定量结果的平均值分别计算加标回收率，见表6。 化合物 LoW Medium High 加标浓度 回收率% 加标浓度 回收率% 加标浓度 回收率% ng/mL ng/mL ng/mL VA 50.0 109.5 250.0 106.9 1000.0 104.3 25OH-VD3 2.5 91.7 12.5 100.2 50.0 105.4 25OH-VD2 2.5 106.4 12.5 104.7 50.0 104.9 VE 500 107.2 2500.0 101.5 10000.0 104.9 VK1 1.25 102.7 6.25 99.7 25.0 102.7 表6. VA、VD3、VD2、VE和VK1在低、中、高浓度时的加标回收率。 批内和批间精密度 低、中、高浓度质控样品的配置方法见前面“质控样品的配置”。每个批次每个低、中、高浓度点各处理5个样品，每个样品进样1针，根据5针定量结果分别计算批内精密度。分别进行3个批次的样品分析，根据3个批次，每个批次每个浓度各5个点的定量结果计算批间精密度，见表7。 化合物 Low QC Medium QC High QC 平均值ng/mL 批内CV% 批间CV% 平均值ng/mL 批内CV% 批间CV% 平均值ng/mL 批内CV% 批间CV% VA 58.5 1.6 2.6 269.8 1.1 2.6 1046.2 1.3 2.1 25OH-VD3 29.2 2.2 2.6 39.4 2.1 4.8 79.6 1.5 3.8 250H-VD2 3.27 2.3 3.3 13.7 1.9 3.0 53.1 2.2 2.8 VE 544.2 1.0 2.1 2546.7 2.2 2.1 10507.1 4.1 2.8 VK1 1.3 2.3 3.0 6.2 1.5 1.9 25.7 2.5 3.2 表7.5种脂溶性维生素在低、中、高浓度的质控样品中的批内和批间精密度。 基质效应考察 因为脂溶性维生素是内源性化合物，所以本方案采用的是含5%BSA的PBS溶液做标准曲线定量法。同时我们也考察了固相萃取前处理后的血清基质与溶剂对比的基质效应，结果如下图5。可见VA、25OH-VD3、25OH-VD2、VE、VK1用同位素内标校正后5个化合物的基质效应都在90%-110%之间。 图5.固相萃取前处理后的血清基质与溶剂对比的基质效应(SPE后的加标浓度VA：200 ng/mL；25OH-VD2： 10 ng/mL；25OH-VD3： 10 ng/mL； VE： 2000 ng/mL；VK1： 5ng/mL的标准品)。 结论 本应用纪要使用Waters UPLC I-Class Xevo TQ-SIVD结合固相萃取的样品前处理方法，建立了血清样品中5种脂溶性维生素VA、25OH-VD2、25OH-VD3、VE、VK1的高灵敏度定量检测方法。样品前处理操作简便、快速，每天可以完成100例以上的样本分析。本方案线性范围覆盖临床检测所需要的定量范围，5个化合物的加标回收率在90%-110%之间，批内和批间精密度均<10%，保证了样品检测的准确性和稳定性，非常适合临床大批量样本的高通量快速检测。 扫一扫，关注沃特世微信 Waters 沃特世科技(上海)有限公司 北京：010-57690500 THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 广州：020-2829 6555 Waters China Limited 香港：852-29641800 免费售后服务热线：800(400)820 2676WWW.waters.com 使用UPLC Xevo TQ-S IVD系统快速分析血清中种脂溶性维生素 前言本应用纪要使用固相萃取的前处理方法净化富集血清中VA、25OH-VD2、25OH-VD3、VE和VK1，色谱分离用BEH Phenyl色谱柱(2.1×50 mm，1.7 µm)，采用Waters UPLC I-Class Xevo TQ-S IVD超高灵敏度的三重四极杆质谱，ESI(+)的离子化方式，建立了血清样品中同时检测五种脂溶性维生素的快速、简便、高灵敏度的定量分析方法。技术优势■ 使用Xevo TQ-S IVD系统，标配的ESI源，一针进样，同时分析五种脂溶性维生素成分，分析效率大大提高。■ ACQUITY UPLC I-Class超高效液相显著缩短运行时间，提高样品通量，减少溶剂用量。■ 使用PRiME HLB µElution板进行快速的样品前处理，富集目标成分的同时更有效去除血清基质中的干扰物。结论本应用纪要使用Waters UPLC I-Class Xevo TQ-S IVD结合固相萃取的样品前处理方法，建立了血清样品中5种脂溶性维生素VA、25OH-VD2、25OH-VD3、VE、VK1的高灵敏度定量检测方法。样品前处理操作简便、快速，每天可以完成100例以上的样本分析。本方案线性范围覆盖临床检测所需要的定量范围，5个化合物的加标回收率在90% - 110%之间，批内和批间精密度均<10%，保证了样品检测的准确性和稳定性，非常适合临床大批量样本的高通量快速检测。