血清中脂溶性维生素检测方案(液质联用仪)

SSL-CA20-538Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-554 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.- Analytical Applications CenterTel： 86(21)34193996Email： sshzyan@shimadzu.com.cnhttp：//www.shimadzu.com.cn 串联质谱用于血清中脂溶性维生素含量测定 LCMSMS-554 摘要：使用串联质谱建立了血清中VA、250HVD2、25OHVD3、VE和 VK1同时测定方法，使用内标、标准品及质控品进行了方法的线性、准确度及精密度的考察。结果显示该方法线性良好，标准曲线相关系数均大于0.996，质控品测定准确度结果与理论值接近，回收率在94%~108%之间， RSD 在 1.9%~6.2%之间，该方法前处理简便，分析速度快，灵敏度高，专属性强，可用于血清脂溶性维生素含量测定。 关键词：串联质谱脂溶性维生素 血清 脂溶性维生素 (fat-soluble vitamins) 是不溶于水而溶于脂肪及非极性有机溶剂(如苯、乙醚及氯仿等)的一类维生素，包括维生素 A(VA)、维生素 D(VD)、维生素 E(VE)和维生素K1(VK1)。维生素A缺乏引起夜盲症、上皮干燥、增生及角化，眼干燥症等。维生素D，俗称“阳光维生素”，主要生理功能是将血钙和血磷水平维持在正常范围内，对于维持钙的代谢和骨骼健康至关重要。血清中25-羟基维生素 D2(25OHVD2)和25-羟基维生素 D3(250HVD3)的浓度测量，，已经应用于监控人体内维生素D的状况及低血钙代谢性骨疾病和高血钙代谢性骨疾病的鉴别诊断。维生素E具有抗衰老、抗癌及防止动脉粥样硬化作用，促进生殖功能使促性腺激素分泌增加，参与多种酶活动增强微粒体 中混合功能氧化酶的活性。维生素K1可以促进肝脏合成四种凝血因子，凝血酶原、转变加速因子，抗血友病因子，促进血液凝固，并可以舒张内脏平滑肌，缓解肾绞痛、胆绞痛、泌尿系出血。由于遇光遇热不稳定，且血清中含有大量干扰物质等，血清中脂溶性维生素的测定十分困难，一针法同时测定脂溶性维生素更是鲜有报道。 本文使用超高效液相色谱三重四极杆质谱仪LCMS-8045，建立了血清中VA、250HVD2、250HVD3、VE和VK1 同时测定方法，该方法前处理简便，分析速度快，灵敏度高，专属性强，可用于脂溶性维生素含量测定。 实验部分 1.1仪器 本实验使用用高效液相色谱与三重四极杆质谱仪 LCMS-8045联用系统。具体配置为： 输液泵：LC-40DXR×2在线脱气机： DGU-405自动进样器：SIL-40C XR柱温箱： CTO-40C 系统控制器：CBM-40 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱： Shim-pack GIST 50 mm×2.1 mm I.D.，2 um； P/N： 227-30001-02；岛津(上海)实验器材有限公司 流速：0.4mL/min 流动相：A：0.1%甲酸水<(含2mM乙酸铵)B：0.1%甲酸甲醇(含2mM乙酸铵)柱温：40℃洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为70%，洗 进样量：10uL 脱程序见表1。 表1 梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 0.20 泵 B.Conc 70 1.50 泵 B.Conc 100 5.50 泵 B.Conc 100 5.51 泵 B.Conc 70 7.00 控制器 Stop 质谱条件： 分析仪器：LCMS-8045 DL温度：150℃ 离子源： ESI (+) 加热模块温度：500℃ 雾化气流速：3.0 L/min 离子源温度：300℃ 干燥气流速：10.0L/min 扫描模式：多反应监测 (MRM) 加热器流速：10.0 L/min MRM 参数：见表2 表2 MRM 参数 名称 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias (V) CE (V) Q3 Pre Bias (V) VA 269.3 93.2 -14 -21 -19 269.3 119.2 -14 -21 -12 VA-IS 274.3 93.2 -14 -21 -19 25OHVD2 413.3 337.3 -11 -12 -12 413.3 355.3 -13 -10 -25 250HVD2-IS 419.3 355.5 -13 -10 -25 250HVD3 401.3 365.3 -12 -12 -26 401.3 257.0 -10 -14 -12 250HVD3-IS 407.4 371.4 -12 -12 -26 VE 431.4 137.1 -12 -20 -24 431.4 165.1 -13 -65 -30 VE-IS 437.4 143.1 -12 -20 -24 VK1 451.4 187.1 -12 -23 -19 451.4 197.0 -12 -26 -13 VK1-IS 458.5 194.1 -12 -23 -19 1.3标准品及样品制备 基质匹配标准曲线制备：取5种脂溶性维生素混标母液，用甲醇稀释成相应浓度混混液。内标溶液使用乙腈：甲醇=9：1溶液配置成内标工作液。取 180 uL5%BSA溶液， 20 uL混标液，涡旋混匀10s， 得替代基质标准溶液。 标准品及样品溶液制备：取200uL替代基质标准溶液或样品，400uL内标工作液，涡旋混匀1 min，加入1mL正己烷，涡旋混匀1 min， 4000 rpm 离心5 min， 取800 pL上清液，室温氮气吹干，复溶后上机测定。 结果讨论 2.1 MRM色谱图 图1标准曲线最低点谱图 2.2线性测定结果 对标准品按1.2中的分析条件进行分析，内标法制作标准曲线。标准曲线结果见表3，5种脂溶性维生素在标准曲线浓度范围内线性相关系数均大于 0.996，准确度在93.9%~110.2%之间，满足测定需求。 表3 标准曲线结果 编号 名称 线性方程 线性范围(ng/mL) 相关系数 准确度(%) 1 VA Y=(0.00792700)X+(0.207331) 20~2000 0.9968 95.6~110.0 2 250HVD2 Y= (0.0308505)X+ (0.00544785) 0.5~50 0.9994 96.0~105.2 3 250HVD3 Y=(0.0135708)X+(0.00469350) 1~100 0.9987 93.9~110.2 4 ·VE Y=(0.00113429)X+(0.0422688) 200~20000 0.9992 97.1~104.2 5 VK1 Y=(0.0687768)X+(0.00103948) 0.1~10 0.9992 95.1~104.4 2.3准确度及精密度测定结果 按1.3中的前处理方法对 5%BSA 中添加标准溶液作为质控品，每个浓度质控品重复制备3份，按1.2中的分析条件对质控品进行分析，质控品的准确度结果如表4所示，结果显示质控品测定准确度结果与理论值接近，回收率在94%~108%之间， RSD 在1.9%~6.2%之间，满足临床测定需求。 表 4 质控准确度考察结果(n=3， 浓度单位 ng/mL) 质控 项目 VA 250HVD2 250HVD3 VE VK1 LQC 理论浓度 40 1 2 400 0.2 测定浓度 43.1 0.96 2.11 412 0.21 回收率% 108 96 106 103 105 RSD% 5.1 6.2 3.7 2.6 4.5 MQC 理论浓度 200 5 10 2000 1 测定浓度 210 4.8 9.6 2135 1.05 回收率% 105 96 96 107 105 RSD% 3.1 4.5 3.1 2.3 3.2 HQC 理论浓度 1000 25 50 10000 5 测定浓度 1021 23.8 47.1 10326 5.12 回收率% 102 95 94 103 102 RSD% 2.3 2.8 3.1 1.9 2.2 2.4临床样品测定结果 取4批次血清样品，按1.3中的前处理方法及1.2中的分析条件进行测定，结果见图2和表5，该方法灵敏度及分离度可满足临床检验需求。 图2 sample1色谱图 表5 临床样品测定结果 (ng/mL) Name samplel sample2 sample3 sample4 VA 721 210 371 148 250HVD2 0.52 N.D. 0.58 N.D. 25OHVD3 5.61 5.24 2.72 4.77 VE 7711 75621 4927 8041 VK1 0.89 0.84 0.65 0.90 结论 使用超高效液相色谱仪三重四极杆质谱仪 LCMS-8045联用，建立了血清中VA、25OHVD2、25OHVD3、VE和VK1同时测定方法，使用内标、标准品及质控品进行了方法的线性、准确度及精密度的考察。结果显示该方法线性良好，标准曲线相关系数均大于0.996，质控品测定准确度结果与理论值接近，回收率在94%~108%之间，RSD 在1.9%~6.2%之间，该方法前处理简便，分析速度快，灵敏度高，专属性强，可用于人体脂溶性维生素含量测定。 岛津应用云 使用超高效液相色谱仪三重四极杆质谱仪LCMS-8045联用，建立了血清中VA、25OHVD2、25OHVD3、VE和VK1同时测定方法，使用内标、标准品及质控品进行了方法的线性、准确度及精密度的考察。结果显示该方法线性良好，标准曲线相关系数均大于0.996，质控品测定准确度结果与理论值接近，回收率在94%~108%之间，RSD在1.9%~6.2%之间，该方法前处理简便，分析速度快，灵敏度高，专属性强，可用于人体脂溶性维生素含量测定。