人血清中维生素K1检测方案(液质联用仪)

SSL-CA14-997Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-390 http：//www.shimadzu.com.cn上海市徐汇区宜州路180号华鑫天地二期C801栋Building C801， No.180 Yizhou Road， ShanghaiHotline： 021-34193996 LCMS-8050 CL 测定血清中的维生素K1 LCMSMS-390 摘要：本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A CL 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 CL联用检测血清中VK1 的检测方法。血清样品使用试剂除蛋白后，萃取离心，浓缩复溶移取上清液，进样分析。采用APCI离子源模式， MRM 模式采集数据，内标法定量，用超高效液相色谱 LC-30A CL 在 7.0 min 内完成分析，三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 CL 进行定量分析。结果显示， VK1在 0.1~12.5 ng/mL 内线性良好；低、中、高三个浓度水平的加标血清样品进行了加标回收率实验，其回收率在85%~113%之间，精密度实验结果良好。该方法可为血清中维生素K1 的临床快速/准确定量分析提供参考。 关键词：维生素K1血清液相色谱-三重四极杆质谱医用质谱仪 维生素K1，又名叶绿醌，在食物、人体中广泛存在。维生素K1是肝脏合成凝血因子Ⅱ、Ⅷ、IX、X所必须的物质，能促进血液凝固；当其缺乏时可引起这些凝血因子合成障碍或异常，临床可见出血倾向，凝血时间延长。目前，维生素K1 的血药浓度测定方法有HPLC 荧光检测法、HPLC-UV 法、GC-MS 法和 HPLC-APCI/MS 法。这些方法的操作过程繁琐，成本较高，不利于大量生物样品的分析。国外权威医学机构 Mayo报道人体中正常维生素K1的含量大约为0.1~2.2ng/mL， 随食物及时间的不同，其浓度的波动范围没 有显著变化。本文建立了灵敏度较高，且满足临床需求的人血清中维生素K1 的 HPLC-APCI/MS/MS 测定法，经方法学验证定量限浓度为 0.1 ng/mL， 线性范围0.1~12.5 ng/mL， 可应用于血清中维生素K1的定性定量研究。 本文利用岛津超高效液相色谱仪和三重四极杆质谱仪LCMS-8050CL联用对人血清中维生素K1进行定性定量分析。有助于高通量、更简单、更安全、更准确地实现临床维生素K1的检测。 1.1仪器 本实验使用岛津临床用超高效液相色谱仪 LC-30A CL 与三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 CL联用系统。具体配置为 LC-30AD CL×2(输液泵)，DGU-20A5R CL(在线脱气机)， SIL-30AC(自动进样器)， CTO-30ACL(柱温箱)， CBM-20A CL系统控制器，LCMS-8050 CL 三重四极杆质谱仪，LabSolutions Ver.5.91色谱工作站。 1.2分析条件 液相条件： 流动相：A相-0.1%甲酸水溶液；B相-甲醇 流速：0.5mL/min 色谱柱： BEH C182.1 mm l.D. ×100 mm L.， 1.7 um 柱温：40℃ 进样体积：20uL 洗脱方式：梯度洗脱，见表1 表1梯度洗脱条件 时间 单元 处理命令 值 0.00 泵 B.Conc 85 3.50 泵 B.Conc 90 4.00 泵 B.Conc 100 7.00 泵 B.Conc 100 7.10 泵 B.Conc 85 11.00 控制器 Stop 质谱条件： 离子源：APCI干燥气流量：5.0 L/min加热块温度：250℃ 接口电压：3.0KV 雾化气：3.0 L/min接口温度：300℃ DL 管温度：150℃ 扫描模式：MRM模式，见表2 表2MRM参数 化合物 CAS No. 英文名 前体离子 产物离子 Q1 Pre CE Q3 Pre Bias Bias (V) (V) (V) 维生素K1 84-80-0 Phylloquinone 451.35 187.15* -14 -27 -19 451.35 185.20 -14 -22 -19 D7-维生素K1 1233937-39-7 D7- Phylloquinone 458.30 194.10 -20 -23 -18 *定量离子对 1.3标准品、及样品制备 标准溶液配制：维生素K1标标品称取适量乙醇溶剂配制1.0 mg/mL的单标准贮备液，用30%甲醇-水溶液逐步稀释成0.1、0.2、0.5、1.25、2.5、5和12.5 ng/mL系列浓度的标准工作液。 样品前处理方法：取200pL标准溶液或血清加入500 uL含内标(2ng/mL) 蛋白沉淀剂(乙腈-甲醇=9：1)，振荡均匀10 min 后加入800 uL正己烷振荡15 min， 10000 rpm 离心3 min，取750pL上清液吹干后用100 uL甲醇-水-0.1%甲酸 (85：15)的混合溶剂复溶，振荡均匀10 min 后， 10000 rpm 离心3min， 转瓶进样20 uL。 ■结果讨论 2.1空白及标准品色谱图 图1标准品 Level 1 浓度色谱图 图2空白基质色谱图 2.2基质效应验证 使用配制标准曲线的基质(30%甲醇-水)溶解高、中、低三个不同浓度水平的标准溶液，分别将标准溶液和基质样本按1：1比例进行混合得混合样本，将混合样本平行处理3个样，上机检测；混合样本的响应值(待分析物/内标)与病人样本和标准溶液响应均值的差异应小于20%，则说明无相对基质效应。其中理论浓度为进行1：1混合后混合样本的理论值，应为基础浓度均值的一半。验证结果如表3所示。 基础浓度 基础浓度均值 理论浓度 实测浓度 回收率 (ng/mL) (ng/mL) (ng/mL) (ng/mL) (%) 4.38 2.16 98.9 4.28 4.35 2.18 2.13 97.8 4.40 2.27 104.1 7.35 3.47 91.4 7.07 7.57 3.79 3.65 96.4 8.31 3.33 88.0 9.65 4.76 100.2 9.47 9.50 4.75 4.29 90.4 9.38 4.98 104.8 2.3线性范围 对标准品按1.2中的分析条件进行了6个批次的分析，内标法制作校准曲线。表4，表5显示，该方法线性范围宽，最低点信噪比 S/N>10， RSD=2.85%小于20%，标准曲线相关系数均大于0.995，因此方法定量限为0.1 ng/mL，线性范围为 0.1~12.5 ng/mL. 表4线性范围验证 60 0.1 103.1 137 0.2 89.8 109 0.5 113.5 6 4 1，803 1.25 92 0.997 5 2，340 2.5 100.3 6 4，428 5 95.1 8，771 12.5 106.3 Y=0.776087X-0.0252136 图3维生素K1的线性方程及相关系数 表5线性范围结果汇总 方法检出限LOD 方法定量限 LOQ 线性范围AMR K1 (ng/mL) 0.05 0.1 0.1~12.5 2.4准确度及精密度 分别制备并处理已知浓度的低、中、高三个浓度的样品， LQC 为 2.0 ng/mL、MQC 为 9.0 ng/mL、HQC为11.0ng/mL，按1.3所述前处理方法处理后进样分析，精密度结果如表6。通过基质加标的方式验证准确度，结果如表7所示。从表中可见，维生素K1准确度RSD 在89.3%~109.2%范围内，精密度分别在5.5%~7.9%范围内，均符合标准。 表6批内精密度考察结果 样品编号 时间 低浓度 时间 中浓度 时间 高浓度 min) (ng/mL) (min) (ng/mL) (min) (ng/mL) 1 6.99 2.00 7.16 8.60 7.14 11.32 2 6.99 1.94 7.11 8.02 7.04 11.61 3 6.98 2.11 7.11 9.54 7.06 11.92 4 7.00 1.96 7.05 8.35 7.03 10.96 5 6.99 2.23 7.04 9.50 7.02 9.50 6 6.98 2.13 7.12 8.30 7.03 10.59 平均值 6.99 2.06 7.10 8.72 7.05 10.98 RSD(%) 0.07 5.54 0.63 7.42 0.67 7.87 表7准确度考察结果 基础浓度 (ng/mL) 基础浓度均 (ng/mL) 理论仑度 (ng/mL) 实测浓度 (ng/mL) 回收率(%) 0.26 4.38 91.6 0.21 0.26 4.50 4.28 89.3 0.31 4.40 92.0 0.26 7.35 96.2 0.21 0.26 7.37 7.07 92.4 0.31 8.31 109.2 0.26 9.65 96.9 0.21 0.26 9.69 9.47 95.0 0.31 9.38 94.1 2.5临床可报告范围 采用高浓度加标样本，用30%甲醇-水溶液，分别将其稀释2、4倍，稀释前与稀释后的病人样本分别平行处理3个，每个检测一次，以稀释前的浓度为参考靶值，计算各稀释后后度样本的回收率，回收率在85%~115%之间则认为该稀释倍数可接受。检测结果如表8所示，维生素K1可接受的倍数至少为4倍，则维生素K1的临床可报告范围为(CRR) 0.1~50 ng/mL， 该范围足以满足临床检测的需求。 表8临床可报告范围考察结果 基础浓度 (ng/mL) 基础浓度均(ng/mL) 理论浓度 (ng/mL) 实测浓度(ng/mL) 回收率(%) 9.65 4.76 98.1 9.47 9.69 4.85 4.29 88.5 9.38 4.98 102.7 9.65 2.36 97.7 9.47 9.69 2.42 2.09 86.5 9.38 2.60 107.4 2.6携带效应 取样本加标至高浓度曲线点附近，作为高浓度度本ULOQ；取病人样本加加至低浓度曲线点附近，作为低低度样本LLOQ； C1=LLOQ， C2=ULOQ， C3=LLOQ；按照C1-C2-C3顺序检测，重复检测3次； (C3-C1) /C1峰面积比值小于20%；检测结果如表9所示，说明携带效应通过，满足检测要求。 表9携带效应考察结果w 样品编号 K1 结果(ng/mL) (C3-C1)/C1 (%) C1-1 0.93 C2-1 6.21 4.93 C3-1 0.98 C1-2 0.99 C2-2 6.26 -2.83 C3-2 0.96 C1-3 1.00 C2-3 6.52 1.50 C3-3 1.02 2.7实际样本测定 表10实际样本测定结果 图4实际血清样本1色谱图 图5实际血清样本2色谱图 ■结论 本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A CL和三重四极杆质谱仪LCMS-8050 CL联用检测血清中VK1的检测方法。此方法经过验证，无携带效应，VK1 在 0.1~12.5 ng/mL内线性良好，线性相关系数大于0.995；低，中，高三个浓度水平的加标回收率在85%~113%之间，保留时间和含量相对标准偏差分别在0.07~0.67%和5.54~7.87%之间，仪器和方法的精密度良好。同时经过基质效应的验证，可使用纯溶剂替代生物基质进行校准曲线的配制和使用，该方法验证均能满足临床检测的需求，可为临床检测维生素K1提供参考。LC-30A CL 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 CL 充用系统可满足临床检测维生素K1的需求。 岛津企业管理(中国)有限公司分析中心 Shimadzu(China)CO.，LTD. Analytical Applications Center ( 咨询电话：021-34193996 ) 建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A CL和三重四极杆质谱仪LCMS-8050 CL联用检测血清中VK1的检测方法。此方法经过验证，该方法无携带效应，VK1在0.1~12.5 ng/mL内线性良好，线性相关系数大于0.995；低，中，高三个浓度水平的加标回收率在85% ~ 113%之间，保留时间和含量相对标准偏差分别在0.07 ~ 0.67%和5.54 ~ 7.87%之间，仪器和方法的精密度良好。同时经过基质效应的验证，可使用纯溶剂替代生物基质进行校准曲线的配制和使用，该方法验证均能满足临床检测的需求，可为临床检测维生素K1提供参考。LC-30A CL和三重四极杆质谱仪LCMS-8050 CL联用系统可满足临床检测维生素K1的需求。