血浆中特立帕肽检测方案(液相色谱仪)

SSL-CA20-259Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-491 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.-Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cnTel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn 超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用法测定人血浆中多肽类药物特立帕肽含量 LCMSMS-491 摘要：本文建立并验证了使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8060 联用测定人血浆中特立帕肽的方法。人血浆样品采用固相萃取法进行前处理制备，取上清液进样分析，可在7 min 内快速、准确地检测血浆中特立帕肽含量。本实验对方法选择性、线性范围、定量下限、精密度、回收率、基质效应、残留等项目均进行考察。结果表明该方法满足生物样品方法学验证要求，具有分析速度快、灵敏度高、重复性好的特点，适合人血浆中特立帕肽含量的快速准确检测，可用于人体内特立帕肽浓度的测定及其人体药代动力学研究。 多肽类药物是医药行业具有广泛市场前景的研发发展方向之一。|随着生物技术和遗传工程领域的迅速发展，人们可以在短期内合成多种多肽类药物。该类药物以其确切的疗效和较好的安全性，临床治疗地位不断提升，市场用量增长极快。目前药物的使用已经延伸至多种疾病的治疗领域，包括抗感染、抗肿瘤、生理调节、疼痛、心衰、骨质疏松、糖尿病、疫苗等。 特立帕肽是一种合成的多肽激素，为人甲状旁腺素 PTH的1-34氨基酸片段，具有刺激骨形成和骨吸收的生物活性，，可减少绝经后妇女骨折的发生率，根据给药方式的不同，还能提高或降低骨密度。临床上常用于治疗用于原发性骨质疏松及性腺功能减退性骨质疏松、绝经后骨质疏松。特立帕肽原研药厂为美国 礼来公司，伴随其专利的到期，以及更多国内医药企业对多肽类药物的产品优势及市场前景有了更深入的了解，国内特多立帕肽等多肽类仿制药的研发生产水平进入了全新上升的阶段。作为主要的多肽类药物，特立帕肽具有高效且低副作用的治疗功效，未来市场用药量将会进一步提升，患者对多肽类药物的接受程度也将日益提高。 迎合当前市场需求，加快特立帕肽等多肽类仿制药的研发速度，本实验采用岛津 LCMS-8060 建立灵敏、高效的人血浆中特立帕肽含量的检测方法，实现血浆基质中多肽药物的准确测定，以期对药物研制工作与临床精准用药提供技术支撑，供相关人员参考。 1.1化合物信息 表1 化合物信息 化合物名称 英文名 CAS No. 分子式 结构式 特立帕肽 Teriparatide 52232-67-4 C181H291N55OsiS， 人甲状旁腺激素(1-38)(IS) Human Parathyroid 1-38 78232-94-7 C197H319N59O55S， 一 1.2仪器 本实验使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 与三重四极杆质谱仪LCMS-8060 联用系统。具体配置为： 延迟时间： 3ms MRM 参数：见表3 表2梯度洗脱程序 Time(min) Module Command Value 3.00 泵 B.Conc 98 4.50 泵 B.Conc 98 4.60 泵 B.Conc 15 7.00 Controller Stop 表33IMRM优化参数 化合物 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias (V) CE(V) Q3 Pre Bias (V) 特立帕肽 687.60 787.65 -20.0 -21.0 -28.0 824.60 984.10 -24.0 -29.0 -22.0 人甲状旁腺激素(1-38) 638.15 712.60 -22.0 -11.0 -20.0 1.4标准品与质控样品的配制 分别精密称取两份特立帕肽适量，用纯水溶解配制两份1.0 mg/mL特立帕肽储备液，分装，-80℃冻存，待用。取其中一份储备诸用稀释液(20%甲醇水溶液，含0.1%甲酸)逐级稀释成浓度为 0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、、10、30 ug/mL的标准工作曲线；另一份储备液用稀释液分别稀释成浓度为0.02、0.5、25 ug/mL 的质控溶液。分别取标准工作曲线中各浓度点10 uL 加入 990 uL人空白血浆中，依次配制成标准曲线0.1、0.3、13、10、30、100、300 ng/mL；分别取三个不同浓度质控溶液 10 uL 加入990 pL人空白血浆中，依次配制成0.2、5、250 ng/mL质控样品。 精密称取人甲状旁腺激素(1-38)适量，用纯水溶液溶解配制为1.0 mg/mL储备液，分装，-80℃冻存，待用。将配制好的人甲状旁腺激素(1-38)储备液用稀释液(50%甲醇水溶液，含0.1%甲酸)稀释为100 ng/mL 内标溶液，待用。 1.5人血浆样品前处理方法 取人血浆样品200 uL， 依次加入100 ng/mL 内标溶液2uL、乙腈200 uL(含4%氢氧化铵溶液))：，涡旋2 min 后，13000 rpm/min 离心10 min。吸取上清液与1mL纯水进行混匀，并取混合液加入已活化好的96孔固相萃取板，用200 uL 5%甲醇水溶液进行清洗除杂，再用25uL乙腈/水/甲酸 (60：39：1，v/v/v) 平行两次，进行洗脱，压干。收集全部洗脱溶液至蛋白低吸附96孔板中，向孔板内每孔加入50uL纯水进行稀释，涡旋混匀，进样分析，进样体积20 uL。 结果与讨论 2.1标准样品一级质谱图与产物离子扫描质谱图 特立帕肽在一级质谱扫描下主要生成[M+6H]6+准分子离子峰 m/z 687.60、[M+5H]+准分子离子峰m/z824.60，对准分子离子峰 m/z 687.60 进行产物离子扫描，分别生成主要碎片离子为 m/z 787.65；人甲状旁腺激素(1-38)在一级质谱扫描下主要生成[M+7H]+准分子离子峰 m/z 638.15， 对准分子离子峰进行产物离子扫描，生成主要碎片离子为 m/z 712.60，其一级质谱图与产物离子扫描图分别见图1-4。 图1特立帕肽一级质谱图 图2特立帕肽m/z687.60 产物离子扫描图(CE值-20V) LCMSMS-491 图33人甲状旁腺激素(1-38)一级质谱图 图4人甲状旁腺激素(1-38)产物离子扫描图(CE值-20V) 2.2方法选择性 取人空白血浆，按照1.5方法和选定的色谱条件处理并测定，得人空白血浆、0.1ng/mL人血浆基质加标样品的 MRM 色谱图，见图5。结果表明，特立帕肽与内标物的保留时间 tR分别为 1.80 min、1.86 min。人空白血浆中的内源物质干扰，对样品检测无明显影响，方法具有较强选择性。 图5特立帕肽与人甲状旁腺激素(1-38)MRM 色谱图(A、B：人空白血浆；C、D： 0.1ng/mL 特立帕肽血浆样品含内标) 2.3线性范围 按照1.4项下人血浆样品配制方法制备0.1、0.3、1、3、10、30、100、300 ng/mL人血浆标准工作曲线，按照1.5项中人血浆样品前处理方法处理人血浆样品，建立标准曲线，并用内标法进行分析测定。以人血浆中特立帕肽浓度与内标浓度(以1计)的比值X为横坐标，以特立帕肽峰面积与人甲状旁腺激素(1-38)峰面积的比值Y为纵坐标，权重系数为1/C²， 进行线性回归分析，所得标准曲线见图6，人血浆中特立帕肽线性回归方程及相关系数见表4。结果表明特立帕肽在 0.1-300 ng/mL 的浓度范围内线性关系良好。 图6特立帕肽标准曲线 表4特立帕肽标准曲线参数(线性回归，权重系数为Y=1/C) 化合物 校准曲线 线性范围 1((ng/mL) 准确度(%) 相关系数r 特立帕肽 Y=(0.4756615)X+(0.1076508) 0.1-300 89.5-107.8 0.9975 2.4方法精密度与准确度 取已配制好的0.2、5、250 ng/mL 低中高三质控样品以及定量下限0.1ng/mL样品，按照1.5方法制备，每个浓度的人血浆样品在1天内制备6份平行样品分析，连续测定3天，每日随行标准曲线，用测得质控样品中特立帕肽峰面积的RSD%值计算其日间和日内差异，结果见表5。其中特立帕肽最低定量限 S/N 平均值为30.63。结果表明，各浓度水平精密度、准确度以及该方法的灵敏度均在接受标准内，并已满足生物样品检测要求。 表5特立帕肽日内精密度与日间精密度(3天，每天n=6) 样品类型 理论浓浓(ng/mL) 日内精密度 RSD% 日间精密度 RSD% 准确度% LLOQ 0.1 6.66 7.15 89.0-113.5 LQC 0.2 4.39 4.91 93.7-109.5 MQC 5 2.90 4.98 91.5-111.6 HQC 250 2.77 6.73 89.5-109.7 2.5回收率 取浓度为0.2、5、250 ng/mL质控样品(每个浓度重复6次)，按照1.5方法制备，，以人血浆样本制备进样检测后色谱峰面积(A1)与人空白血浆按照1.5方法处理后加入标准品溶液进样检测所得色谱峰面积((A2)之比，即A1/A2×100%，考察人血浆样本处理方法的提取回收率。实验结果见表6，各浓度水平特立帕肽肽收率均大于76%、RSD小于8.6%。 表6方法回收率结果(n=6) 浓度水平 理论浓度 (ng/mL) 平均回收率% RSD% LQC 0.2 76.21 8.57 MQC 5 80.39 4.51 HQC 250 82.69 6.49 2.6基质效应 考察低、中、高三浓度水平质控样品(每个浓度重复5次)，通过比较人空白血浆后加标样品与浓度一致的标准溶液，两者的目标化合物面积平均值所得比值即为基质效应，并计算内标归一化基质效应。结果见表7，各浓度水平基质效应因子均大于81%。 表7基质效应考察结果(n=6) 浓度水平 理论浓度 (ng/mL) 基质效应% 内标基质效应% A/AIS基质效应 LQC 0.2 87.17 88.45 98.55 MQC 5 76.05 93.16 81.63 HQC 250 91.97 96.22 95.58 2.7稳定性式验 为评价生物样品在周围环境(如室温、光照)下的稳定性，将低、中、高三浓度水平质控样品(n=6)在室温桌面放置约4h，按照1.5方法制备并进行测定，将测定值浓度与理论值进行比较。结果显示，三个浓度水平的质控样品测定值与理论值的差异均在±13.7%以内，满足生物样品稳定性检测(偏差±15%以内)法规要求。人血浆中特立帕肽在室温下短期放置(4h)稳定性良好。 2.8系统残留考察 (Carryover) 考察系统残留的影响，完成浓度最高点分析后，其后分析空白样品中特立帕肽的峰面积，空白样品中特立帕肽及其内标物的通道中均没有明显的目标化合物色谱峰。 结论 本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A 和三重四重杆质谱仪 LCMS-8060 联用测定人血浆中特立帕肽的方法。该方法在7 min 内完成人血浆中特立帕肽的检测，采用同位素内标法定量，方法定量下限0.1ng/mL，线性范围0.1-300 ng/mL，相关系数在0.9975。选择性考察结果表明人空白血浆中没有对分析造成明显干扰的物质。方法中定量下限日内、日间精密度6.66%与7.15%，S/N平均值为30.63；低中高三水平质控浓度日内精密度2.77-4.39%，日间精密度4.91-6.73%，准确度89.0-113.5%；各浓度水平质控样品中特立帕肽回收率均大于76%，RSD 小于8.6%，基质效应大于81%；稳定性实验结果显示样品在室温下放置4小时稳定。方法具有分析方法简单、分析速度快、灵敏度高、重复性好的特点，满足特立帕肽体内药物分析要求，为特立帕肽仿制药生物等效性评价提供快速准确的检测方法。 岛津应用云 本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A和三重四极杆质谱仪LCMS-8060联用测定人血浆中特立帕肽的方法。该方法在7 min内完成人血浆中特立帕肽的检测，采用同位素内标法定量，方法定量下限0.1 ng/mL，线性范围0.1-300 ng/mL，相关系数在0.9975。选择性考察结果表明人空白血浆中没有对分析造成明显干扰的物质。方法中定量下限日内、日间精密度6.66%与7.15%，S/N平均值为30.63；低中高三水平质控浓度日内精密度2.77-4.39%，日间精密度4.91-6.73%，准确度89.0-113.5%；各浓度水平质控样品中特立帕肽回收率均大于76%，RSD小于8.6%，基质效应大于81%；稳定性实验结果显示样品在室温下放置4小时稳定。方法具有分析方法简单、分析速度快、灵敏度高、重复性好的特点，满足特立帕肽体内药物分析要求，为特立帕肽仿制药生物等效性评价提供快速准确的检测方法。