血浆中阿达木单抗药物检测方案(液质联用仪)

SSL-CA14-606Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-325 岛津全球应用技术开发支持中心上海市徐汇区宜州路180号华鑫天地二期C801栋 咨询电话：021-34193996http：//www.shimadzu.com.cn nSMOL 技术应用于血浆中阿达木单抗药物的定量检测 LCMSMS-325 摘要：本文使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8060 联用，结合 Skyline 软件，建立了血浆中阿达木单抗药物的分析方法。结果表明，浓度为0.1~20 ug/mL(0.675 nmol/L~135 nmol/L) 范围内的标准曲线相关系数良好(R=0.9982)，标线各点的准确度范围在 94.2~110.0%之间。各浓度样品 (LOQ、MOQ和HOQ)的批内精密度和批间精密度分别为1.2~5.9%和5.7~8.3%，准确度范围为 88.5~114.2%。此方法快速、特异性好和灵敏度高，可作为阿达木单抗临床治疗药物监测的检测方法。 关键词： nSMOL 阿达木单抗治疗药物监测 (TDM) Skyline 类风湿关节炎(RA)是由自身免疫引发的关节炎。以慢性、对称性、多滑膜关节炎和关节外病变为主要临床表现，属于自身免疫炎性疾病。随着RA 发病机制的逐步揭示，针对发病机制各环节进行治疗的生物制剂，如肿瘤坏死因子(TNF)抑制剂等陆续进入临床应用，为RA 患者的治疗带来了希望。 阿达木单抗(Adalimumab)，商品名俢乐美(Humira)，由英国 Cambridge Antibody Technology 与美国雅培公司联合研制的一种 TNF 特异性重组单克隆抗体。2003年1月首次在美国上市，随后相继在德国、英国和爱尔兰获准上市，用于治疗中到重度 RA。2010年2月26日获得中国食品药品监督管理局 (CFDA)批准上市。近年来，阿达木单抗高居全球药物销售榜首，成为最热门药物之一。 随着精准医疗概念的提出，治疗药物监测(TDM) 越来越受到医疗工作者的关注。TDM 能为临床医生提供更准确的信息，从而实现对患者给药方案个体化，提高药物疗效，避免或减少药物毒副反应，达到最佳治疗效果。临床研究表明，单抗药物的血药浓度与患者治疗效果、存活率之间存在显著关联，这将单抗药物的TDM 提升到一个新的高度。因此，开发血浆中阿达木单抗检测方法，用于日常监控阿达木单抗治疗的患者，有着重要临床意义。 本文使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A 和三重四极杆质谱仪LCMS-8060联用，并结合 Skyline软件，建立了血浆中阿达木单抗药物的分析方法，并遵循EMA《Guideline on bioanalytical method validation》完成方法全验证。结果表明，该方法快速、特异性好、灵敏度高，适用于阿达木单抗药物的日常监控。 实验部分 1.1仪器 本实验使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 与三重四极杆质谱仪 LCMS-8060 联用系统。具体配置为 LC-30ADx2(输液泵)，DGU-20A5R(在线脱气机)，SIL-30ACMP(自动进样器)，CTO-20AC(柱温箱)，CBM-20A系统控制器，LCMS-8060 三重四极杆质谱仪， LabSolutions Ver. 5.89 色谱工作站， Skyline Ver.3.7.0.10940 软件。 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱： ACQUITY UPLC Peptide BEH 柱温：40℃ C18 Column (2.1 mmx 150 mm， 1.7 pm) 进样量：15 uL 流动相：A相-0.1%甲酸水溶液； 自动进样器温度：4℃ B 相-0.1%甲酸乙腈溶液 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为5%，时间程序见表1。 表1梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 0.50 Pumps Pump B Conc. 5 6.50 Pumps Pump B Conc. 65 6.60 Pumps Pump B Conc. 95 8.00 Pumps Pump B Conc. 95 8.10 Pumps Pump B Conc. 5 10.00 Controller Stop 质谱条件： 离子源： ESI(+) 加热模块温度：400℃ 雾化气流速：3.0 L/min 干燥气流速：15.0L/min 加热气流速：5.0L/min 扫描模式：多反应监测 (MRM) 接口温度：300℃ 驻留时间：34ms DL温度：150℃ MRM参数：见表2 接口电压：1.0kV 表2 MRM参数 肽段选择 肽段作用 前体离子 产物离子 Qi Pre Bias (V) CE (V) C Q3 Pre Bias (V) 500.35* -26.0 -22.0 -22.0 APYTFGQGTK 定量肽段 535.60 305.35 -26.0 -31.0 -19.0 490.55 -26.0 -25.0 -20.0 P14R 内标 512.10 292.30* -38.0 -20.0 -20.0 389.30 -38.0 -16.0 -28.0 660.40 -38.0 -17.0 -24.0 *表示定量离子对 1.3样品制备 标准溶液配制：将阿达木单抗注射液(5 mg/mL)用 Tris·HCl缓冲液(pH 7.0)稀释成浓度为2.0 ug/mL、4.0ug/mL、10 pg/mL、20 ug/mL、40 ug/mL、100 ug/mL、200 ug/mL 和 400 ug/mL 的标准工作液， P14R 通过 TrisHCl缓冲液(pH 7.0)配制成浓度为10 fmol/pL 的内标工作液备用。190 uL新鲜血浆中分别加入10 pL阿达木单抗标准工作液，配制得到标准曲线溶液，浓度依次为 0.1 ug/mL、0.2 ug/mL、0.5 ug/mL、1.0 ug/mL、2.0 ug/mL、5.0 ug/mL、10 ug/mL 和20 ug/mL。 样品前处理方法：取20uL血浆，按照nSMOL试剂盒操作步骤进行样品前处理，获得的酶解混合物直接上机分析。 结果与讨论 2.1阿达木单抗特征肽段的筛选及碰撞能量优化 利用 Skyline 软件预测阿达木单抗特征肽段，将预测的离子对列表直接导入到 LabSolutions 中建立完整的 LC-MS/MS方法，利用该方法分析检测阿达木单抗酶解产物，然后将分析结果导入 Skyline 软件，删除未检出肽段，结果如图1所示。 图1筛选结果导入Skyline文件后的检出肽段确认 “碰撞能量优化”，导出 MRM 离子对列表，基于筛选时采用的液相分离条件，同步对已筛选的4个肽段的 MRM 通道进行碰撞能量优化。将 LabSolutions 的分析结果导入Skyline 软件，对碰撞能量优化结果进行确认，碰撞能量优化过程重复1次，不同能量下所选择肽段的 MRM 通道面积变化重复性良好(见图2)，最终根据两次分析的平均值导出含有最佳碰撞能量值的 MRM 离子对子表(见表3)。 图2 Skyline软件进行碰撞能量优化结果查看 表3MRM参数(Skyline筛选最佳碰撞能量肽段列表) 肽段选择 前体离子 产物离子 CE (V) APYTFGQGTK 535.60 [M+2H]2+ 500.06[y9]2+ -22.0 305.35[y3]+ -31.0 490.55 [y5]+ -25.0 LLIYAASTLQSGVPSR GLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGR 559.65 359.40 [y3]+ -18.0 602.65[y6]+ -21.0 [M+3H]+ 515.60 [y5] -20.0 359.40[y3]+ -22.0 838.95 [M+2H]2+ 1174.30[y12]+ -35.0 1032.15 [y10]+ 1040.10 [y19]2+ 904.45 [y16]2* 1460.45[y13]+ -34.0 -27.0 -26.0 -37.0 888.60 [M+3H]+ 2.2空白血浆及血浆基质加标中阿达木单抗各MRM 通道色谱图 分别对比空白血浆与血浆基质加标中各个 MRM通道色谱图，发现在空白血浆中目标肽段 LLIYAASTLQSGVPSR和GLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGR 通道均有显著干扰(如图3所示)，因此最终选取 APYTFGQGTK 作为阿达木单抗的定量特征肽段。 1.00(x10，000) (x1.000.000) 图3空白血浆与血浆基质加质(10 ug/mL)中各个MRM通道色谱图 2.3线性范围 浓度为 0.1 ug/mL、0.2ug/mL、0.5 ug/mL、1.0 ug/mL、2.0 ug/mL、5.0 ug/mL、10 ug/mL 和 20 ug/mL 的标准曲线溶液，按照1.3中的样品前处理方法进行处理后按1.2中的分析条件进行测定，以浓度为横坐标，峰面积比为纵坐标，内标法制作标准曲线(图4)。在0.1~20 pg/mL(0.675 nmol/L~135 nmol/L)浓度范围内线性良好，线性方程、线性范围和相关系数见表3。 图4标准曲线 表4标准曲线参数 名称 特征肽段 标准曲线 线性范围 准确度(%) 相关系数r (ug/mL) 阿达木单抗 APYTFGQGTK Y=(0.0543291)X+(2.64118e-005) 0.1-20 94.2-110.0 0.9982 2.4特异性验证 分别考察空白血浆基质、血浆基质加内标和0.1ug/mL 血浆基质加标样品，结果表明，血浆基质对阿达木单抗及其内标的检测均无干扰，同时内标 P14R亦不干扰阿达木单抗的检测(见图5)。 血浆基质加内标 血浆基质加内标 图5特异性验证结果 2.5精密度和准确度 用血浆基质配制定量下限、低、中、高四个浓度的样品，即LLOQ(0.1 ug/mL)、LOQ(0.2 ug/mL)、MOQ(2.0 ug/mL)和HOQ(16 ug/mL)。连续三天对各样品分别测定6次，考察批内、批间的精密度和准确度，结果如表5所示。阿达木单抗的批内和批间精密度分别小于8.3%和9.5%， LLOQ批内和批间准确度在±20%之内，其它浓度的质控样品批内和批间准确度分别为 88.5-110.0%、88.5-114.2%，结果均满足方法学验证标准。 表55批内批间精密度和准确度结果 品 理论浓度 批内(n=6) 批间(n=18) 平均实测值 CV 准确度 平均实测值 CV 准确度 (ug/mL) (ug/mL) (%) %) (ug/mL) (%) (%) LLOQ 0.1 0.106 8.3 91.6-116.9 0.101 9.5 82.8-116.9 LOQ 0.2 0.202 5.9 91.6-110.0 0.204 5.7 91.6-112.5 MOQ 2.0 1.88 1.8 92.5-97.1 2.03 7.2 92.5-114.2 HOQ 16 14.4 1.2 88.5-91.2 15.7 8.3 88.5-110.3 2.6残留考察 在高浓度样品(20ug/mL)后进样分析空白溶剂，考察阿达木单抗及其内标 P14R 的残留情况，结果如图6所示。结果表明，高浓度样品进样分析后，目标物和内标均无明显残留现象。 图6残留考察 2.7基质效应 分别考察 LOQ、MOQ和HOQ样品的基质效应，并通过分析物的基质因子除以内标的基质因子(MF)，计算得到经内标归一化的基质因子 (IS-normalized MF)，结果如表6所示。结果表明，低浓度和高浓度样品及其内标基质因子的 CV(%)小于15%，且内标归一化基质因子的 CV(%) 小于15%。 表6种基质效应考察 项目 LOQ MOQ HOQ MF IS-normalized MF MF IS-normalized MF MF IS-normalized MF 1 0.934 1.25 0.877 1.20 0.874 1.16 2 0.916 1.21 0.905 1.17 0.830 1.12 3 0.838 1.15 0.932 1.25 0.819 1.13 4 0.939 1.31 0.872 1.22 0.874 1.17 5 0.881 1.20 0.875 1.21 0.829 1.13 6 0.863 1.24 0.877 1.21 0.808 1.06 均值 0.895 1.23 0.890 1.21 0.839 1.13 V(%) 4.2 3.9 2.5 1.8 3.1 3.2 2.8稀释可靠性 配制浓度为 100 ug/mL 血浆样品，分别用血浆基质稀释10倍、20倍后，所得样品经前处理后，进样分析。样品测定结果乘以稀释因子，计算得到浓度数值与原始值比较。结果如表7所示，不同稀释倍数下的样品，其精密度和准确度均在±15%之内，表明样品经10倍或20倍稀释后，测定结果仍然可靠。 表7稀释可靠性验证 项目 10 倍稀释 (ug/mL) 20倍稀释(ug/mL) 1 92.3 93.4 2 97.3 99.5 3 98.6 99.5 4 100.7 97.3 5 i102.1 98.4 6 99.6 97.5 均值 98.5 97.6 准确度(%) 92.3-102.1 93.4-99.5 CV(%) 3.2 2.1 2.9稳定性考察 分别考察室温、4℃和-20℃条件下，不同浓度样品储存72h 的稳定性，结果如表8所示。从结果上看，准确度范围在86.5~110.7之间，符合验证要求。 表8样品稳定性考察 项目 室温 4℃ -20℃ LOQ MOQ HOQ LOQ MOQ HOQ 1 0.207 14.5 0.183 1.78 15.2 0.221 1.86 15.6 2 0.201 1.94 14.3 0.214 1.84 14.4 0.212 1.92 15.2 14.2 0.208 1.84 14.5 0.214 1.92 14.9 4 1.85 14.6 0.185 1.79 14.7 0.174 1.73 15.3 准确度(%) 91.6-101.4 92.5-97.1 88.5-90.9 91.7-106.8 86.9-92.0 90.0-94.8 86.9-110.7 86.5-96.0 93.4-97.4 结论 本文使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8060 联用，结合 Skyline 软件，建立了血浆中阿达木单抗药物的分析方法，并遵循 EMA《Guideline on bioanalytical method validation(2012)》完成方法全验证。实验结果显示，浓度为0.1~20 ug/mL(0.675 nmol/L~135 nmol/L) 范围内的标准曲线相关系数良好(R=0.9982)，标线各点的准确度范围在 94.2~110.0%之间。各浓度样品(LOQ、MOQ和 HOQ)的批内精密度和批间精密度分别为1.2~5.9%和5.7~8.3%，准确度范围为 88.5~114.2%；定量下限(LLOQ)样品批内精密度和批间精密度分别为8.3%和9.5%，准确度范围为 82.8~116.9%。此方法快速、选择性强和灵敏度高，所得结果均满足方法验证标准，可作为阿达木单抗TDM 的检测方法。 使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A和三重四极杆质谱仪LCMS-8060联用，结合Skyline软件，建立了血浆中阿达木单抗药物的分析方法，并遵循EMA《Guideline on bioanalytical method validation (2012)》完成方法全验证。实验结果显示，浓度为0.1~20 μg/mL（0.675 nmol/L~135 nmol/L）范围内的标准曲线相关系数良好（R=0.9982），标线各点的准确度范围在94.2~110.0%之间。各浓度样品（LOQ、MOQ和 HOQ）的批内精密度和批间精密度分别为1.2~5.9%和5.7~8.3%，准确度范围为88.5~114.2%；定量下限（LLOQ）样品批内精密度和批间精密度分别为8.3%和9.5%，准确度范围为82.8~116.9%。此方法快速、选择性强和灵敏度高，所得结果均满足方法验证标准，可作为阿达木单抗TDM的检测方法。