人血清中脂溶性维生素含量检测方案(液质联用仪)

SSL-CA22-131Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-642 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD. - Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cnTel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn 基于 CLAM+LCMSMS的全自动分析系统检测人血清中脂溶性维生素含量 LCMSMS-642 摘要：本文建立了岛津在线自动前处理仪 CLAM-2030 和超高效液相三重四极杆质谱仪LCMS-8050CL 联用系统测定人血清中5种脂溶性维生素含量的方法。此联用系统利用蛋白沉淀的原理实现自动化样本前处理及在线LC-MS/MS分析，只需简单放入采血管、配合脂溶性维生素专用试剂盒及方法包，便可完成实时的在线分析。本文对分析方法的线性、准确度和精密度性能做了考察，并检测6例临床样本，结果显示：各分析物线性范围内校准曲线相关系数均大于0.9966，质控品准确度均值靶值范围内，精密度CV 值均小于11%，实测临床样本无基质干扰，可满足临床检验需求。该方法自动化程度高，对检测人员友好，有助于更快、更简单、更安全地完成日常临床检测任务。 维生素A、维生素D、维生素E和维生素K为四种常见脂溶性维生素。维生素A缺乏病是由于膳食中维生素A或其前体胡萝卜素缺少或吸收不良而引起的全身性疾病，其主要病理变化是全身上皮组织角质变性，于眼部出现最早，可引起视觉功能异常，并影响呼吸道、消化道、泌尿生殖道等的黏膜，乃至皮肤、骨骼及免疫系统。维生素D，俗称“阳光维生素”，主要生理功能是将血钙和血磷水平维持在正常范围内，以维持大部分生命过程不可或缺的代谢功能，血清中25OHD2 和250HD3的浓度测量已经应用于监控人体内维生素D 的状况及低血钙代谢性骨疾病和高血钙代谢性骨疾病的鉴别诊断。维生素E是体内生物膜上的重要组成部分，当维生素E缺乏时，生物膜上的多不 饱和脂肪酸容易发生过氧化反应，以红细胞为例，其细胞膜上的多不饱和脂肪酸因发生过氧化反应而受损时会发生溶血反应，继而出现贫血症状。维生素K1，又名叶绿醌，在食物、人体中广泛存在。维生素K1是肝脏合成凝血因子Ⅱ、Ⅷ、IX、X所必须的物质，能促进血液凝固；当其缺乏时可引起这些凝血因子合成障碍或异常。 本文利用在线自动前处理仪 CLAM-2030 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8050CL联用对人血清中维生素A、250HD2、250HD3、维生素E和维生素K1进行定性定量分析。有助于高通量、更简单、更安全、更准确地实现临床脂溶性维生素的检测。 实验部分 1.1仪器 本实验使用岛津在线自动前处理仪 CLAM-2030 和岛津临床质谱 LCMS-8050CL，具体配置如下： 输液泵： LC-30ADX2检测器： LCMS-8050CL脱气机：DGU-20A5R前处理模块： CLAM-2030自动进样器：SIL-30AC系统控制器：CBM-20A 柱温箱： CTO-20A 工作站软件： LabSolutions Version 5.93 图11CLAM-2030+LCMS-8050CL联用系统 1.2分析条件 色谱柱： Shim-pack GIST C18 (50 mm ×2.1mm×2um)，岛津(上海)实验器材有限公司，P/N： 227-30001-02 流动相：A相-水，B相-0.1%甲酸甲醇(含1mM甲酸铵) 洗脱方式：梯度洗脱，时间程序见表1 流速：0.5 mL/min 柱温：50C 进样器温度：15℃ 进样量：40uL 表1 梯度洗脱程序 时间(min) A (%) B(%) 0.01 30 70 0.20 30 70 3.80 0 100 5.90 0 100 6.00 30 70 7.00 30 70 质谱条件 离子化模式： APCI(+) 雾化气：氮气3.0 L/min 干燥气： OFF 驻留时间：18 ms 离子源温度：375℃DL管温度：225C加热模块温度：250℃扫描模式：多反应监测(MRM) 表2 MRM 参数 # 名称 前体离子>产物离子 Q1 Pre CE Q3 Pre 250H-VD2 395.35>377.35 -13 -19 -16 25OH-VD3 383.35>365.30 -13 -15 -22 3 250H-VD2-d3 398.35>380.25 -24 -18 -24 4 250H-VD3-d6 389.35>371.25 -13 -17 -25 5 VA 269.30>93.20 -14 -21 -19 6 VA-d6 275.30>96.20 -16 -20 -34 VE 431.40>137.10 -12 -20 -24 8 VE-d6 437.40>171.20 -12 -23 -24 9 VK1 451.35>187.15 -14 -27 -19 10 VK1-d7 458.50>194.10 -20 -23 -19 1.3样品制备和前处理 1.3.1标准样品、质控品及样品制备 标准样品和质控品：使用脂溶性维生素检测试剂盒(液夜色谱-串联质谱法，苏州帕诺米克公司，产品编号：DP000008，批号：2021122101)。该试剂盒包含以下部分：样本提取剂：维生素A-d6、25-羟基维生素 D2-d3、25-羟基维生素D3-d6、维生素E-d6、维生素K1-d7、稳定剂、防腐剂；校准品：6个浓度水平冻干粉样本(含标准浓度的维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素E、维生素K1)；质控品：3个浓度水平冻干粉样本(含标准浓度的维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素E、维生素K1)。 临床样本：6例人血清临床样本来自上海市某医院(仅作科研用途) 1.3.2样品前处理 在 CLAM-2030 工作站界面优化自动前处理参数、蛋白沉淀剂使用量、震摇转速、震摇时间、抽滤时间等。确定样品自动前处理程序具体操作为： (1)[吸取20uL甲醇活化过滤管，准备上样； 吸取校准品、质控品或血清样品30 uL上样； 吸取样本提取剂150 uL； (4)转速2000 rpm 震摇30s进行提取； (5)使用-50~-60 kPa 的负压抽滤过滤管60s； (6)接收管转移至自动进样器，进样40 uL (详见图2)。 图2CLAM-2030在线自动前处理过程 实验结果 2.1线性关系 将6个标准浓度的校准品按1.3.2中前处理条件进行分析测定，以浓度比为横坐标，面积比为纵坐标，内标法制作校准曲线得到相关系数、线性范围和校准品准确度见表3. 表3 标准曲线参数 (1/C²加权) # 名称 相关系数 线性范围 (ng/mL) 准确度(%) 1 25OH-VD2 0.9981 2.5~75 89.0~109.8 2 25OH-VD3 0.9996 5~150 97.0~102.3 3 VA 0.9997 50~1500 97.8~103.5 4 VE 0.9995 1000~30000 95.2~108.6 5 VK1 0.9966 0.1~3 89.0~105.7 2.2精密度&准确度实验 本实验分别对低、中、高浓度质控样品进行5次重复测定，精密度相对标准偏差范围分别在3.99%~10.99%(LQC)、2.31%~9.49%0(MQC)、1.70%~10.14%(HQC)之间，准确度结果均落在质控品允许范围内，满足临床检测要求，数据结果见附录表4~表6。 表4 LQC 精密度&准确度结果(n=5) # 名称 均值(ng/mL) CV(%) 理论值 (ng/mL) 准确度要求 25OH-VD2 7.5 10.99 6~9 满足 2 25OH-VD3 15.0 5.99 12~18 满足 3 VA 152.8 9.80 120~180 满足 4 VE 2984.1 3.99 2400~3600 满足 5 VK1 0.31 9.74 0.24~0.36 满足 表5MQC精密度&准确度结果(n=5) # 名称 均值(ng/mL) CV(%) 理论值(ng/mL) 准确度要求 1 250H-VD2 22.4 2.31 18~27 满足 2 250H-VD3 45.8 4.02 36~54 满足 3 VA 441.7 9.29 360~540 满足 4 VE 9201.2 3.14 7200~10800 满足 5 VK1 0.89 9.49 0.72~1.08 满足 表6HQC精密度&准确度结果(n=5) # 名称 均值(ng/mL) CV(%) 理论值(ng/mL) 准确度要求 1 250H-VD2 42.8 1.70 36~64 满足 2 25OH-VD3 88.6 1.92 72~108 满足 3 VA 874.1 10.14 720~1080 满足 4 VE 17719.1 2.17 14400~21600 满足 5 VK1 1.69 3.48 1.44~2.16 满足 2.3临床样本实测 为考察本方法在实际样本检测中抗干扰能力，分别选取6例临床样本进行测试(其中01、02号为正常血清样本，04、05、06号分别为轻度溶血、轻度黄疸和轻度脂血样本)，各维生素浓度检测结果详见表7，临床样本色谱图详细图3。 表7 临床样本实测结果(单位：ng/mL) # 名称 样本01 样本02 样本03 样本04 样本05 样本06 1 250H-VD2 BLQ 2.8 BLQ BLQ 6.6 BLQ 2 25OH-VD3 25.4 13.2 22.2 19.7 10.5 15.8 3 VA 601.9 389.8 462.1 329.2 508.7 218.6 4 VE 12814.0 10297.1 15114.4 8777.6 10123.1 12038.6 5 VK1 0.66 0.59 0.29 0.37 0.30 0.37 *BLQ表示低于定量下限 图3 临床样本(01号)250H-VD2、25OH-VD3、VA、VE、VK1色谱图 2.4方法定量限 250H-VD2、250H-VD3、VA、VE和VK1方法定量限分别2.5、5、50、1000和0.1 ng/mL， 定量限色谱图详见图4。 图4 定量限250H-VD2、250H-VD3、VA、VE、VK1色谱图 结论 本文建立了一种使用岛津在线自动前处理仪 CLAM-2030及岛津临床质谱 LCMS-8050CL 联用系统测定人血清中5种脂溶性维生素含量的方法。此方法使用岛津在线自动前处理方法进行 LC-MS/MS分析，内标法定量，每个样品分析时间仅需7 min， 在线性范围内，5种维生素相关系数均>0.9966，定量限分别为2.5 ng/mL(250H-VD2)、5 ng/mL(250H-VD3)、50 ng/mL(VA) 1000 ng/mL(VE)、0.1 ng/mL(VK1)。质控品均在靶值范围内，质控品精密度 RSD 均<11%，实测临床样本无基质干扰，可满足临床日常检验需求。 此联用系统在线自动处理样品且数据重复性好，消除手动操作生物样品带来的风险，最大限度地减少操作人员与生物样本的接触，只需简单放入采血管、必要试剂和专用处理管，便可进行在线自动前处理，每个样品并行处理，以优化仪器的使用和样品通量，并且通过软件来管理试剂、校准曲线、控制样品和系统维护，确保系统的性能和可靠性，系统提供可视化的图表和数据，可实时提醒用户试剂量的减少或QC样品结果的变化等，是一种全自动化的分析系统。 岛津应用云 本文建立了一种使用岛津在线自动前处理仪CLAM-2030及岛津临床质谱LCMS-8050CL联用系统测定人血清中5种脂溶性维生素含量的方法。此方法使用岛津在线自动前处理方法进行LC-MS/MS分析，内标法定量，每个样品分析时间仅需7 min，在线性范围内，5种维生素相关系数均>0.9966,定量限分别为2.5 ng/mL(25OH-VD2)、5 ng/mL(25OH-VD3)、 50 ng/mL(VA) 1000 ng/mL(VE)、 0.1 ng/mL(VK1)。质控品均在靶值范围内，质控品精密度RSD均<11%，实测临床样本无基质干扰，可满足临床日常检验需求。此联用系统在线自动处理样品且数据重复性好，消除手动操作生物样品带来的风险，最大限度地减少操作人员与生物样本的接触，只需简单放入采血管、必要试剂和专用处理管，便可进行在线自动前处理，每个样品并行处理，以优化仪器的使用和样品通量，并且通过软件来管理试剂、校准曲线、控制样品和系统维护，确保系统的性能和可靠性，系统提供可视化的图表和数据，可实时提醒用户试剂量的减少或 QC 样品结果的变化等，是一种全自动化的分析系统。