血清中维生素K2(MK-4)检测方案(液质联用仪)

SSL-CA22-201Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-660 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD. -Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cn Tel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn LC-MS/MS 法检测血清中维生素K2(MK-4) LCMSMS-660 摘要：本文使用岛津超高效液相色谱三重四极杆质谱联用仪，建立了血清中维生素K2(MK-4)测定方法，对方法的线性范围、准确度及精密度进行了考察。结果显示该方法线性良好，质控品测定准确度结果与理论值接近，该方法前处理简便、分析速度快、灵敏度高，可用于血清中MK-4含量测定。 关键词：三重四极杆液质联用仪维生素K2(MK-4) 血清 维生素K2 (menaquinones，甲萘醌)是由人体肠道有益菌群产生的微量脂溶性维生素，具有叶绿醌生物活性的萘醌基团的衍生物，是人体中不可缺少的重要维生素之一。维生素K2共有14种形式，通常用英文字母MK来表示，分别是MK-4、MK-7、MK-8、MK-9等。其中最常见的有合成的 MK-4 和天然的MK-7，对骨骼健康及心血管健康有重要作用。据文献报道， MK-4正 常参考值范围为0.07~2.68 ng/mL， MK-7正常参考值范围为 0.33~4.48 ng/mL"。目前，维生素K2已经受到全世界的广泛关注并成为研究热点。 本文使用超高效液相色谱三重四极杆质谱仪LCMS-8050， 建立了血清中维生素K2(MK-4)测定方法，该方法前处理简便、分析速度快、灵敏度高，可供相关人员参考。 实验部分 1.1仪器 岛津LCMS-8050 三重四极杆液质联用系统。配置信息如下： 系统控制器： SCL-40自动进样器：SIL-40CX3柱温箱：CTO-40C输液泵： LC-40BX3脱气机：DGU-405工作站： Labsolutions Ver. 5.99 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱： Shim-pack Velox C18 (100 mmL.×2.1mml.D.， 2.7um，岛津(上海)实验器材有限公司，P/N： 227-32009-03) 流动相：A相-0.1%甲酸水溶液，B相-0.1%甲酸甲醇溶液 流速：0.5 mL/min 柱温：40℃ 进样体积： 30uL 洗脱方式：采用梯度洗脱，B相初始浓度为85%，时间程序见表1。 表1 梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 3.00 泵 B.Conc 85 4.00 泵 B.Conc 95 7.00 泵 B.Conc 95 7.01 泵 B.Conc 10 10.00 控制器 Stop 质谱条件 分析仪器： LCMS-8050 DL温度：200℃ 离子源： APCI (+) 加热模块温度：200℃ 雾化气流速：3.0L/min干燥气流速： 5.0L/min 接口温度：350C 扫描模式：多反应监测(MRM) 碰撞气：氩气 MRM参数：见表2 表2 MRM参数 名称 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias(V) CE (V) Q3 Pre Bias (V) MK-4 445.3 187.1* -22.0 -25.0 -19.0 227.1 -22.0 -21.0 -21.0 MK-4 D7 452.3 194.1 -22.0 -25.0 -19.0 *表示定量离子 1.3标准品及样品制备 标准工作溶液：精密称取MK-4适量，用乙醇溶解配制成 100 ug/mL 储备液。用50%乙醇水溶液逐级稀释成浓度为100、50、20、10、5、2、1、0.5ng/mL的标准工作溶液； 内标溶液：精密称取 MK-4D7适量，用乙醇溶醇配制为 100 ug/mL 储备液。用50%乙醇水溶液稀释为10ng/mL 内标溶液。 标准曲线：分别取标准工作溶液各浓度点10 uL， 加入10uL内标溶液， 再加入80 uL初始比例流动相，依次配制成0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ng/mL标准曲线溶液。 样品制备：取200uL血清样本，加入10 uL 内标溶液及 400 uL乙醇，涡旋混匀1 min， 加入1mL正己烷，涡旋混匀3 min， 12000 rpm 离心10 min， 取 850 uL上清液，室温氮气吹干，复溶后上机测定。 结果讨论 2.1MRM 色谱图 图1 标准曲线最低点色谱图 2.2校准曲线 对标准曲线溶液按1.2中的分析条件进行分析，内内法制作校准曲线。线准曲线结果见图2及表3，MK-4在校准曲线浓度范围内线性良好，相关系数为 0.9982， 准确度在94.3%~108.6%之间。 图2 校准曲线图谱 表3 校准曲线信息 名称 线性方程 线性范围(ng/mL) 相关系数r 准确度(%) MK-4 Y=(0.832914)X+(-0.00133796) 0.05~10.0 0.9982 94.3~108.6 2.3准确度及精密度 分别取处理后且已知浓度的低、中、高三个浓度的质控样品， LQC 为 0.25 ng/mL、MQC 为1.0 ng/mL、HQC为5.0 ng/mL， 每个浓度平行制备六份质控样品，按1.3所述前处理方法处理后进样分析，准确度及精密度结果如表4所示。结果显示质示品测定准确度结果与理论值接近，平均回收率在92.7%~100.8%之间， RSD在 4.55%~7.65%之间。 表4质控准确度考察结果(n=6，浓度单位 ng/mL) 项目 LQC MQC HQC 理论浓度 0.25 1.00 5.00 测定浓度 0.23 1.01 4.70 回收率% 92.7 100.8 93.9 RSD% 7.65 4.55 4.95 2.4样品测定 取2批次血清样品，经前处理后分别进行测定，结果如下。 图3 血清样品色谱图 表5 样品检测结果 编号 MK-4(ng/mL) 样品1 0.43 样品2 0.16 结论 使用超高效液相色谱三重四极杆质谱联用仪LCMS-8050，建立了血清中维生素K2(MK-4)测定方法。该方法采用内标法定量，在0.05~10.0 ng/mL 范围内线性关系良好，相关系数均大于0.998；质控品测定准确度结果与理论值接近，平均回收率在92.7%~100.8% 之间， RSD 在 4.55%~7.65%之间。该方法操作简单且灵敏可靠，可供相关行业人员参考使用。 ( 参考文献 ) [1] Fusaro M， Noale M， Viola V， Galli F， Tripepi G， Vajente N， et al. Vitamin K， vertebral fractures， vascularcalcifications， and mortality： VItamin K Italian (VIKI) dialysis study.J Bone Miner Res 2012；27：2271-8. 岛津应用云 使用超高效液相色谱三重四极杆质谱联用仪LCMS-8050，建立了血清中维生素K2（MK-4）测定方法。该方法采用内标法定量，在0.05~10.0 ng/mL范围内线性关系良好，相关系数均大于0.998；质控品测定准确度结果与理论值接近，平均回收率在92.7%~100.8%之间，RSD在4.55%~7.65%之间。该方法操作简单且灵敏可靠，可供相关行业人员参考使用。