人血清中维生素A含量检测方案(液相色谱仪)

SSL-CA22-184Excellence in Science Excellence in ScienceLC-300 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD. -Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cn Tel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn 使用 On-line SPE 液相色谱分析系统快速检测人血清中维生素A含量 LC-300 摘要：本文使用岛津 On-line HPLC 生物样品分析系统 Co-Sense for BA， 建立了快速检测人血清中维生素A含量的测定方法。该方法在5 min 内即可完成血清预处理样品在线净化、富集及检测，维生素A采用内标法定量，检出限可达1 ng/mL； 在10-1000 ng/mL 浓度范围内线性关系良好，相关系数r大于0.9998；精密度实验结果显示保留时间 RSD 小于0.1%，峰面积及测定浓度的 RSD 小于0.9%，仪器精密度优异；低、中、高浓度加标样品回收率均在95%-105%之间。实验结果表明，该方法能快速稳定准确地测定人血清中维生素A的含量。 关键词： On-line SPE Co-Sense for BA 血清 维生素A 内标法 维生素A是维持人体正常代谢功能所必需的脂溶性维生素，其缺乏或过量均可导致相应疾病。近年来的研究发现，维生素A与儿童的生长发育及一些营养代谢疾病有密切关系。因此，建立测定人血中维生素A含量对于与维生素相关疾病的临床预防、诊断、治疗具有重要的意义。 维生素A常用的检测方法是 HPLC 法，其样品处理需采用蛋白沉淀结合液液萃取的方式进行，所需样品量大、前处理复杂耗时，成本较高，且难以实现样品前处理自动化。 岛津 On-line HPLC 生物样品分析系统 Co-Sensefor BA 是一套采用在线除蛋白及分析物捕集-分离-定量检测的二维液相色谱系统。本文使用上述分析系统，建立了内标法快速检测人血清中维生素A含量的测定方法。该方法中，血清样品仅需蛋白沉淀后即可进样检测，在5 min 内完成血清样品处理及检测，所需样品量少，样品预处理简单快速可自动化批量处理，成本低廉，操作简单，适用于临床大规模样品检测需求。 生物样品分析系统 Co-Sense for BA， 配置信息及工作原理如下： 系统控制器： CBM-20A自动进样器： SIL-20A HT输液泵：LC-20AT脱气机： DGU-20A3R检测器： SPD-20A柱温箱： CTO-20A 1.2分析条件 色谱柱： Shim-pack GIST (100mm×3mml.D.，3 um)(岛津(上海)海验器材有限公司， P/N： 227-30009-05) SPE 前处理柱： Shim-pack MAYI-ODS (10 mm ×4.6 mml.D.， 50 um) (岛津(上海)实验器材有限公司， P/N： 228-40835-91) 流动相A： 50%甲醇水 流动相B：95%甲醇水 流速：泵A2mL/min， 泵B 0.8mL/min柱 温 ： 4 0 ℃ 进样体积：50uL 检测波长：325 nm 洗脱方式：等度洗脱，切换阀初始值为0，时间程序如表1所示。 表1 阀切换时间程序 时间(min) 单元 处理命令 值 操作状态 Initial 柱温箱 切换阀 0 除蛋白、捕集 1.00 柱温箱 切换阀 1 样品分析 4.00 柱温箱 切换阀 0 再平衡 5.00 控制器 Stop 1.3标准品溶液及加标血清样品配制 标准品中间液制备：取2000 ug/mL维生素A母液，用乙腈稀释至 50 ug/mL，然后用乙腈逐级稀释制备浓度为50，125，250，500，1250，2500，5000 ng/mL 的标准曲线中间溶液，避光冷藏。 内标工作液制备：取2000pg/mL 维生素A醋酸酯母液，用乙腈逐级稀释至200 ng/mL，避光冷藏。 校准曲线工作液制备：取上述标准曲线中间液100 uL， 加400 uL内标工作液，涡旋混匀，制备浓度为10，25，50，125，250， 500， 1000 ng/mL校准曲线工作溶液，避光冷藏。 加标工作液制备：取2000 ug/mL 维生素A母液，用乙腈逐级稀释制备浓度为2500，5000， 10000 ng/mL的加标工作溶液，避光冷藏。 加标血清样品制备：取100uL血清样品，各取上述加标工作液10 uL， 涡旋2 min 即得，冷藏备用。 1.4样品前处理方法 取血清及加标血清样品，涡旋混匀，精密吸取100pL， 置1.5mL离心管中，加入400 uL内标工作液，涡旋混匀2 min， 静置1 min 后， 14000 rpm离心5分钟，取上清液进样分析。 结果与讨论 2.1检出限 配制1ng/mL标准品溶液，进样检测，其色谱图如图2所示，以 ASTM 方式计算得到的 S/N 为7.76，以此数据计算得到的检出限为 0.5 ng/mL。 图2 1 ng/mL标准品溶液色谱图 2.2系统残留 进样 1000 ng/mL标准品溶液后，进样空白甲醇溶剂，考察系统残留。结果显示，维生素A 无明显系统残留。图3为甲醇溶剂与最低浓度校准品 (10ng/mL) 对比图。 图3甲醇溶剂与最低浓度校准品 (10 ng/mL)对比图 2.3线性关系 进样检测10，25，50，125，250，500， 1000 ng/mL校准曲线溶液，结果如下所示。 图4标准曲线 2.4精密度考察 使用血清样品，经前处理后，取上清液，重复进样6次，其结果如下表所示。 表2血清样品精密度实验结果(n=6) # R.T.(min) Area Conc.(ng/mL) 1 2.956 63025 95.350 2 2.954 62873 95.762 3 2.953 62881 96.250 4 2.953 62193 94.310 5 2.954 61798 94.861 6 2.949 61821 95.337 平均值 2.953 62432 95.312 RSD(%) 0.08 0.90 0.71 2.5加标回收率 使用血清样品及用其配制的低、中、高浓度加标血清样品，经前处理后取上清液，重复进样3次，取平均值计算加标回收率，其结果如下表所示。 表3 加标回收率实验结果 # 血清 加标50 ng/mL 加标 100 ng/mL 加标200ng/mL 1 95.350 146.029 199.743 298.969 测定浓度 (ng/mL) 2 95.762 146.567 200.598 300.130 3 96.250 147.316 201.524 301.554 平均匀 (ng/mL) 95.787 146.637 200.622 300.218 回收率(%) - 101.7 104.8 102.2 RSD)((%) 0.47 0.44 0.44 0.43 2.6样品测定 取人血清样品，按照1.4中样品前处理方法处理6份样品，上机检测，结果如下。 图5 血清样品维生素A及内标色谱图 表4血清样品维生素A检测结果 样品 血样1 血样2 血样3 血样4 血样5 血样6 x±s 含量 (ng/mL) 95.350 95.762 96.250 94.310 94.8610 95.3370 95.312±0.677 结论 本文使用 On-line HPLC 生物样品分析系统 Co-Sense for BA， 建立了内标法快速检测人血清中维生素A含量的测定方法。该方法在5 min 内即可完成血清样品处理及检测，方法验证结果表明，该方法灵敏度高、稳定性好，可以简便快速准确地测定人血清中维生素A的含量，可满足自动快速高通量检测的临床实际需求，适用于大规模临床样本的检测。 岛津应用云 本文使用On-line HPLC生物样品分析系统Co-Sense for BA，建立了内标法快速检测人血清中维生素A含量的测定方法。该方法在5 min内即可完成血清样品处理及检测，方法验证结果表明，该方法灵敏度高、稳定性好，可以简便快速准确地测定人血清中维生素A的含量，可满足自动快速高通量检测的临床实际需求，适用于大规模临床样本的检测。