血清中血管紧张素I、II检测方案(液相色谱仪)

SSL-CA20-157Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-469 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.- Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cn Tel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn LCMS-8050 CL 同时测定血清中血管紧张素I、Ⅱ LCMSMS-469 摘要：本文利用岛津临床用 LCMS-8050 CL 三重四极杆液质联用系统建立了人血清中血管紧张素1、Ⅱ同时分析的方法。该方法采用内标法定量，线性相关系数在0.998以上；人血清样品中添加两个不同浓度的标准溶液，加标回收率在 99.2~107.5%之间，平行处理三次的相对标准偏差在 0.33~8.45%之间，方法准确可靠，可用于实际样品的检测。 关键词：LCMS-8050 CL三重四极杆液质联用系统血清 血管紧张素 肾素-血管紧张素系统 (RAS) 是人体调节血压的重要的内分泌系统，由一系列激素及相应的酶所组成，在调节水、日电解质平衡以及血容量、血管张力和血压方面具有重要作用。肾素是由肾脏近球体分泌分子量为40000的一种羧基蛋白水解酶，它作用于血管紧张素原产生血管紧张素1(Angl)，血管紧张素|本身无生理活性，在血管紧张素转换酶的作用下水解为有活性的血管紧张素Ⅱ (Angll)，血管紧张素Ⅱ可引起小动脉血管收缩，促进肾上腺皮质合成和分泌醛固酮。 血浆肾素活性(PRA) 和Ang II的检测已成为肾性高血压、内分泌型高血压的诊断所必需，也是高肾素低血容量型高血压、低肾素高血容量型高血压、正 常肾素正常血容量型高血压分类的依据。血浆肾素活性(PRA)的测定多以血管紧张素的产生速率来间接反映，血管紧张素Ⅱ可直接测定。目前检测血管紧张素Ⅰ、Ⅱ的方法大多采用免疫法或者采用高效液相色谱法与酶联免疫相结合，但此类方法制备抗体复杂，特异性较差。液相色谱串联质谱法具有比较高的灵敏度及特异性，样品前处理简单，检测结果更加准确可靠。 本文采用岛津临床用三重四极杆液质联用仪LCMS-8050 CL， 建立了人血清中血管紧张素1、Ⅱ同时分析的方法，该方法灵敏度高、分析速度快，供相关人员参考。 实验部分 1.1仪器 岛津 LCMS-8050 CL 三重四极杆液质谱联用系统。具体配置为 LC-30AD CL×2输液泵，DGU-20A5 CL 在线脱气机， SIL-30ACMP CL 自动进样器， CTO-30A CL 柱温箱， CBM-20A CL 系统控制器， LCMS-8050 CL 三重四极杆质谱仪， LabSolutions Ver. 5.97 色谱工作站。 1.2分析条件 液相色谱条件： 色谱柱： Shim-pack Scepter C18-120(100mm×2.1mm l.D.， 3 um， Shimadzu SGLC P/N： 227-31014-05) 流动相：A相-0.5%乙酸水；；B相-乙腈 流速：0.4mL/min 柱温：40℃ 进样量：20uL 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为10%，时间程序见表1。 表1 梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 0.05 泵 B.Conc 10 2.00 泵 B.Conc 30 3.00 泵 B.Conc 98 5.00 泵 B.Conc 98 5.01 泵 B.Conc 10 7.00 控制器 Stop LCMS-8050 CL 质谱条件： 离子源： ESI(+) 接口电压：1.0kV 雾化气流速：3L/min 加热模块温度：400℃ DL温度：200℃ 扫描模式：多反应监测(MRM) 接口温度：300C 干燥气流速：10.0 L/min MRM 参数：见表2 加热气流量：10.0L/min 表2 MRM 参数 中文名 简写 前体离子 产物离子 Q1Pre Bias(V) CE(V) Q3 Pre Bias(V) 血管紧张素1 Angl 432.9 110.1* -10 -29 -12 647.3 -23 -18 -36 血管紧张素1-内标 Ang I-IS 435.1 110.1* -10 -29 -12 654.3 -16 -19 -34 血管紧张素Ⅱ AnglI 523.8 263.2* -28 -22 -28 784.3 -26 -20 -22 血管紧张素Ⅱ-内标 Ang lI-IS 527.3 791.3* -26 -21 -24 263.2 -28 -22 -13 注：*表示定量离子 1.3标准曲线的配置 称取1.0 g BSA 溶于50mL PBS， 配制 2% BSA 溶液作为血清的替代基质溶液，用于配制标准工作曲线。取血管紧张素I、Ⅱ标准贮备液，用2% BSA 溶液做溶剂逐级稀释为20、40、80、200、500、11250 pg/mL的标准系列工作溶液。 1.4样品前处理方法 血清样品预处理：取血清样品，按每1mL血清样品加入10 uL 8-羟基喹啉 (0.32 mol/L)，涡旋混匀静置30 min。 取150 uL标准样品或预处理后的血清样品，加入50uL内标工作液(1ng/mL)，再加入450 uL1%氨水，涡旋混匀；取600 uL上述处理后的溶液至已活化好的 MAX型 96孔固相萃取板中((固相萃取板经150 uL 乙腈活化后再经150 uL1%氨水平衡))；；使用正压装置将液体全部压下，下接废液收集板，弃去废液；使用100uL含1%氨水的10%乙腈溶液洗涤固相萃取板2次并压干；换用全新低吸附96孔接收板，使用45 uL含1%甲酸的10%乙腈溶液洗脱固相萃取板2次，将洗脱液转至低吸附进样小瓶中，上机分析。 结果与讨论 2.1标准曲线最低点 MRM 色谱图 Q432.90>110.10 (+) 3.54e3Q523.80>263.20(+) 2.05e3 图1 标准曲线最低点 (20 pg/mL) MRM 色谱图 2.2线性范围 按照1.3配制标准系列工作溶液，参考1.4的前处理流程，处理后直接上机分析，以内标法绘制标准曲线，标准曲线如图2，曲线结果如下表3所示，所得校准曲线线性关系良好，线性相关系数在0.998以上，准确度在96.1%-105.5%之间。 图2 血管紧张素1、Ⅱ标准曲线 表3 标准曲线结果 化合物 线性方程 线性范围(pg/mL) 相关系数 准确度(%) Angl Y=(0.003644494)X+(0.002491907) 20-1250 0.999 96.1-105.5 Angl Y=(0.008085581)X-(0.009704865) 20-1250 0.998 97.2-103.8 2.3重复性考察 用含1%甲酸的10%乙腈溶液配制40 pg/mL混合标准溶液，连续进样6次，考察保留时间和峰面积的重复性，结果如下表4所示。保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD%)分别小于 0.28%和6.41%，仪器精密度良好。 表4 重复性测试(n=6) 化合物 40pg/mL 保留时间 RSD% 峰面积RSD% Ang1 0.22 5.11 Angll 0.28 6.41 2.4加标回收实验 人血清样品中添加两个不同浓度的标准溶液，每个浓度的加标样品平行处理三份，结果如表5所示，两个不同浓度加标回收率在99.2~107.5%之间，平行处理三次的相对标准偏差在0.33~8.45%之间，方法准确可靠。 表5 加标回收实验结果(n=3) 化合物 加标浓度 回收率% 重复性 加标浓度 回收率% 重复性 (pg/mL) RSD% (pg/mL) RSD% AngI 80 107.5 8.45 400 102.5 0.33 Angll 80 99.2 4.41 400 106.5 0.89 结论 本实验建立了一种使用岛津临床用超高效液相色谱仪 LC-30A CL 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 CL 联用同时测定人血清中血管紧张素1、Ⅱ的方法。采用内内法定量，灵敏度高、分析速度快，前处理采用 MAX 型96孔固相萃取板，操作简单；人血清样品中两个不同浓度的加标回收率在99.2~107.5%之间，平行处理三次的相对标准偏差在0.33~8.45%之间，方法准确可靠，，可用于临床及科研工作中血管紧张素Ⅰ和Ⅱ浓度的检测，供相关从业人员参考。 岛津应用云 本实验建立了一种使用岛津临床用超高效液相色谱仪LC-30A CL和三重四极杆质谱仪LCMS-8050 CL联用同时测定人血清中血管紧张素I、II的方法。采用内标法定量，灵敏度高、分析速度快，前处理采用MAX型96孔固相萃取板，操作简单；人血清样品中两个不同浓度的加标回收率在99.2~107.5%之间，平行处理三次的相对标准偏差在0.33~8.45%之间，方法准确可靠，可用于临床及科研工作中血管紧张素I和II浓度的检测，供相关从业人员参考。